李 偉，李雙霞，孟元華，李鳳玉，張奇芳，高靈娟，李宏偉，田玉旺

乳腺惡性葉狀腫瘤被認(rèn)為源自小葉內(nèi)或?qū)Ч苤車g質(zhì)的惡性改變，發(fā)生率明顯低于乳腺癌，但其是乳腺惡性間葉性腫瘤中最常見的腫瘤。目前，乳腺惡性葉狀腫瘤發(fā)病具體病因還不明確。有資料[1-2]顯示，乳腺惡性葉狀腫瘤的發(fā)病不僅與種族、年齡和地域等因素有關(guān)外，可能還與生育哺乳、內(nèi)分泌變化及多基因變異等有關(guān)。Piwil2蛋白正常表達(dá)僅見于胚胎干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞，其他組織均未見表達(dá)；但也見于各種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系，其過表達(dá)已被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)志[3]，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。已有研究[4]發(fā)現(xiàn)，Piwil2蛋白的表達(dá)在乳腺癌組織中有高的靈敏度及特異性。目前有關(guān)Piwil2蛋白與乳腺惡性葉狀腫瘤之間的研究鮮見報(bào)道，鑒于此，本實(shí)驗(yàn)研究主要探討Piwil2蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素之間的關(guān)系，并分析其表達(dá)對(duì)病人10年生存預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 收集2000年3月至2010年6月期間中國(guó)人民解放軍陸軍第81集團(tuán)軍醫(yī)院病理科及中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心病理科存檔乳腺惡性葉狀腫瘤女性病人資料50例，年齡45～61歲，平均(52±3.5)歲，中位年齡56歲，其中≥56歲者26例、<56歲者24例；腫瘤直徑7～15 cm，平均(9±1.2)cm，中位直徑10 cm，腫瘤直徑≥10 cm者29例、<10 cm者21例；Ki-67≥25%者40例，<25%者10例；瘤細(xì)胞異型性顯著者38例，不顯著者12例；CyclinD1蛋白陽(yáng)性36例，陰性14例；術(shù)后復(fù)發(fā)10例，未復(fù)發(fā)40例；核分裂≥15個(gè)/10HPF者29例，<15個(gè)/10HPF者21例；淋巴結(jié)均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。同時(shí)選取因乳腺炎切除的乳腺正常組織70例作為對(duì)照組。所有病人均為首次手術(shù)治療，之前均無(wú)放化療史。

1.2 方法 濃縮型鼠抗人單克隆抗體Piwil2購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，按1∶200稀釋濃度滴加標(biāo)本。采用羅氏全自動(dòng)免疫組織化學(xué)機(jī)及配套試劑進(jìn)行染色操作，實(shí)驗(yàn)操作步驟按說明書要求進(jìn)行。具體操作步驟如下：石蠟防脫片切片4 μm，組織漂烘儀65 ℃烤片1 h，雀巢全脂牛奶浸泡15 min，放入羅氏全自動(dòng)免疫組織化學(xué)機(jī)，99 ℃修復(fù)1 h，再將預(yù)先配置好的Piwil2 一抗(1∶200) 滴入標(biāo)本，30 min，加生物素標(biāo)記過的二抗，9 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色 8 min，洗潔精洗片，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。奧林巴斯顯微鏡下觀察和分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。

1.3 結(jié)果判斷 Piwil2蛋白表達(dá)染色判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野并依據(jù)以下評(píng)分，(1)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的染色呈棕黃色或棕褐色，按基本不著色、著色淡、著色適中、著色深分別為0、1、2、3分；(2)染色細(xì)胞百分率評(píng)分按著色細(xì)胞計(jì)數(shù)≤5%為0分、>5%～25%為1分、>25%～50%為2分、>50%為3分；(3)將上述兩項(xiàng)得分相乘為其最后得分，0～1分為陰性(-)、2～3分為弱陽(yáng)性(+)、≥4分為強(qiáng)陽(yáng)性(2+)。染色結(jié)果判讀由2名以上資深病理醫(yī)生進(jìn)行雙盲評(píng)估，其中弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性按陽(yáng)性表達(dá)統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)和Kaplan-Meier檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Piwil2蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織及正常乳腺組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Piwil2蛋白著色于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。Piwil2蛋白在50例乳腺惡性葉狀腫瘤組織中43例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率86.00%；Piwil2蛋白在70例乳腺正常組織中陽(yáng)性表達(dá)0例，陽(yáng)性率0.00%。2組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=93.82，P<0.01)(見圖1、2)。

2.2 Piwil2蛋白的表達(dá)與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理因素的相關(guān)分析 結(jié)果顯示，腫瘤直徑≥10 cm、Ki-67≥25%、瘤細(xì)胞異型性、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)及核分裂≥15個(gè)/10HPF病人Piwil2蛋白的表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)，而病人不同年齡及術(shù)后是否復(fù)發(fā)Piwil2蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 Piwil2蛋白的表達(dá)與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理因素的相關(guān)分析

2.3 Piwil2蛋白的表達(dá)與乳腺惡性葉狀腫瘤病人10年生存率的相關(guān)性 隨訪乳腺惡性葉狀腫瘤病人10年，43例Piwil2蛋白陽(yáng)性表達(dá)病人，存活28例，生存率為65.12%；7例Piwil2蛋白陰性表達(dá)病人，存活7例，生存率為100.0%；Piwil2蛋白陰性表達(dá)病人10年生存率高于Piwil2蛋白陽(yáng)性表達(dá)病人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.95，P<0.05)(見圖3)。

3 討論

乳腺纖維上皮性腫瘤是由上皮成分和數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的間質(zhì)成分構(gòu)成的一組異源性腫瘤，其主要分為纖維腺瘤和葉狀腫瘤。纖維腺瘤最常發(fā)生在育齡期婦女，尤其是30歲以下的婦女，也有學(xué)者認(rèn)為其是乳腺正常小葉成分增生而不是真正的腫瘤。葉狀腫瘤相比纖維腺瘤少見，占全部乳腺原發(fā)性腫瘤的0.3%～1%[6]，其好發(fā)于中年婦女，發(fā)病年齡比纖維腺瘤大15～20歲。葉狀腫瘤根據(jù)間質(zhì)細(xì)胞增生程度、細(xì)胞異性型及核分裂等分為良性、交界性及惡性，盡管惡性葉狀腫瘤臨床上更少見，但其是乳腺惡性間葉肉瘤中最常見的腫瘤。有人認(rèn)為葉狀腫瘤與乳腺纖維腺瘤明顯相關(guān)，甚至可能由纖維腺瘤演變而來(lái)[7]。部分學(xué)者認(rèn)為乳腺惡性葉狀腫瘤來(lái)自原始間葉細(xì)胞，但也有學(xué)者認(rèn)為是成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞。組織病理學(xué)通常表現(xiàn)為纖維肉瘤改變，但也可異源性分化，如脂肪肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤等，這提示瘤細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞多向分化的潛能。

Piwil蛋白在多種細(xì)胞進(jìn)程中起重要作用，如干細(xì)胞自我更新、RNA沉默、精子發(fā)生、翻譯調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑等。到目前為止，人類Piwil家族中4個(gè)成員已被識(shí)別，分別為Piwil1、Piwil2、Piwil3、Piwil4[8]，其中Piwil2僅表達(dá)于正常人體內(nèi)睪丸和造血干細(xì)胞[9]。何朝輝等[5]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌組織中Piwil2蛋白的表達(dá)明顯高于正常組織，與臨床分期相關(guān)，并影響膀胱尿路上皮癌的生物學(xué)行為，且有可能成為高風(fēng)險(xiǎn)膀胱癌病人的預(yù)后指標(biāo)[10]。但也有研究[11-14]顯示，Piwil2蛋白參與了乳腺癌、肝癌、前列腺癌等多種腫瘤的形成、發(fā)展，其機(jī)制是通過激活內(nèi)源性RNAi，活化Stat3/Bcl-XL和Sta3/CyclinD1兩個(gè)重要的細(xì)胞信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)擴(kuò)增。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Piwil2蛋白在正常乳腺組織無(wú)表達(dá)，在惡性葉狀腫瘤組織中表達(dá)明顯高于纖維腺瘤，因而推測(cè)，纖維腺瘤中Piwil2蛋白的表達(dá)可能是發(fā)展演變成惡性葉狀腫瘤的前驅(qū)事件。此與FENG等[15]的研究結(jié)果相似。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，乳腺惡性葉狀腫瘤Piwil2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與Ki-67≥25%、核分裂≥15個(gè)/10HPF明顯相關(guān)，提示Piwil2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的分裂、增殖能力，更有利于瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲。乳腺惡性葉狀腫瘤Piwil2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示Piwil2蛋白的表達(dá)與CyclinD1蛋白的表達(dá)之間存在相互協(xié)調(diào)強(qiáng)化作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，生存分析結(jié)果顯示，乳腺惡性葉狀腫瘤Piwil2蛋白陽(yáng)性表達(dá)病人10年生存率明顯低于陰性表達(dá)病人。

綜上所述，乳腺纖維腺瘤是具有演變?yōu)槿橄賽盒匀~狀腫瘤的潛在前驅(qū)事件。Piwil2蛋白的表達(dá)水平可為臨床預(yù)測(cè)乳腺惡性葉狀腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為及對(duì)病人預(yù)后的影響提供有價(jià)值的參考。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，Piwil2蛋白也有可能成為乳腺惡性葉狀腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)。