唐軍，李剛敏，孫晨，陳銀，邵茂，姜治樺，陳瑤，謝曉芳，彭成

(西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 611130)

紅花，又名紅藍(lán)花、刺紅花，為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，夏季花由黃變紅采摘，陰干或曬干制成成品，功效為活血通經(jīng)，散瘀止痛，用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、惡露不行、疤痕痞塊、胸痹心痛、瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌撲損傷、瘡癰腫痛[1]。我國(guó)的藥用紅花曾以四川簡(jiǎn)陽(yáng)“川紅花”和河南“懷紅花”最為出名，現(xiàn)在紅花的主產(chǎn)區(qū)則主要是新疆、云南、甘肅一帶，新疆現(xiàn)在是我國(guó)最大的紅花產(chǎn)地，產(chǎn)量占據(jù)了全國(guó)產(chǎn)量的80%以上[2]。本文通過(guò)單味藥評(píng)價(jià)藥效的方式，比較原紅花主產(chǎn)地(四川簡(jiǎn)陽(yáng))和當(dāng)下紅花主產(chǎn)地(新疆昌吉)所制紅花酊對(duì)大鼠軟組織損傷的治療效果，評(píng)價(jià)兩個(gè)產(chǎn)地紅花的藥效，從而為紅花的道地性研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(川)2018-19。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 收集四川簡(jiǎn)陽(yáng)和新疆昌吉人工栽培的紅花，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥種質(zhì)資源庫(kù)陳江副教授鑒定為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花。制備高、低劑量的紅花酊：將簡(jiǎn)陽(yáng)、昌吉紅花分別稱80 g、40 g用紗布包裹，用400 mL 60%乙醇浸泡于4個(gè)密閉容器中，紅花全部淹沒(méi)，靜置一周后過(guò)濾，所得濾液即為對(duì)應(yīng)簡(jiǎn)陽(yáng)、昌吉產(chǎn)地的高、低劑量紅花酊。云南白藥酊(云南省昆明市呈貢新區(qū)云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：ZMC1801)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 95%乙醇，0.9%生理鹽水，2%戊巴比妥鈉溶液，4%多聚甲醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：2020112601)，TNF-α試劑盒(Elabscience，批號(hào)：E-EL-R2856c)，IL-10試劑盒(上海瑞番生物科技有限公司，批號(hào)：MM-0195R1)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 高速冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter,型號(hào)：Allegra X-30R)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司，型號(hào)：DHG-9030A)中，高級(jí)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，型號(hào)：VARIOSKA)，血液流變儀(北京賽科希德科技股份有限公司，型號(hào)：SA-9000)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法

將49只大鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、云南白藥酊組、簡(jiǎn)陽(yáng)紅花高、低劑量組(JY 0.2 g/mL、JY 0.1 g/mL)、昌吉紅花高、低劑量組(CJ 0.2 g/mL、CJ 0.1 g/mL)，每組7只。造模時(shí)，大鼠以50 mg/kg腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉后，將左邊臀部及左下肢毛發(fā)用動(dòng)物剃毛器清除，然后俯臥位固定，在左下肢大腿處墊上紗布，在該大腿上方垂直豎立一根45 cm長(zhǎng)管道，將200 g砝碼從管道上端口放入，使其自由落體砸在大鼠左大腿肌肉豐厚處，重復(fù)6次，觀察造模部位出現(xiàn)瘀斑并明顯腫脹即造模成功，若造模時(shí)有皮膚破損或出血，明顯骨折等情況，則淘汰。

2.2 治療方法

造模1 h后開(kāi)始給藥，蘸取藥液涂抹患處，0.5mL/次，3次/d，連續(xù)4 d。簡(jiǎn)陽(yáng)、昌吉紅花高低劑量組給對(duì)應(yīng)濃度的紅花酊，云南白藥組給云南白藥酊，模型組給0.9%生理鹽水。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

在末次給藥24 h后，將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血制備抗凝血，進(jìn)行血流變學(xué)檢測(cè)。另取未抗凝血2 mL，制備血清，在4℃，離心力746×g條件下離心15 min制備血清，ELISA法檢測(cè)血清中的TNF-α和IL-10水平；處死大鼠，在固定位置取大鼠損傷部位肌肉組織，肉眼觀察后，將其浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，HE染色行病理組織學(xué)觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠血液流變學(xué)的影響

與正常組相比，在6個(gè)不同的切變率下，模型組的全血粘度升高，紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，昌吉紅花高、低劑量組，云南白藥組的全血黏度均降低，昌吉紅花高劑量組、云南白藥組紅細(xì)胞聚集指數(shù)降低，昌吉紅花低劑量組卡松黏度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)如表 1所示。

表1 大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

3.2 對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清TNF-α水平、IL-10水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表示造模成功，與模型組相比較，簡(jiǎn)陽(yáng)紅花高劑量、昌吉紅花高劑量、昌吉紅花低劑量、云南白藥組TNF-α水平降低，昌吉紅花作用最強(qiáng)；云南白藥組、簡(jiǎn)陽(yáng)紅花低劑量組、昌吉紅花高劑量組IL-10水平降低，簡(jiǎn)陽(yáng)紅花低劑量組作用最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且如表 2所示。

表2 大鼠血清炎癥因子

3.3 對(duì)大鼠損傷軟組織形態(tài)學(xué)的影響

造模后大鼠腿部肌肉細(xì)胞形態(tài)異常，肌間明顯水腫增寬、大量炎癥細(xì)胞(以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主)浸潤(rùn)，有明顯出血；與模型組比較，各給藥組組織未見(jiàn)明顯出血，且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，組織間隙的水腫有所減輕，呈現(xiàn)較好的量-效正相關(guān)。

4 討論

軟組織損傷是由各種急性或者慢性勞損以及自身疾病等原因?qū)е碌娜梭w皮膚、皮下筋膜、肌肉、韌帶、肌腱、關(guān)節(jié)囊及周圍神經(jīng)血管組織的病理?yè)p害。臨床主要表現(xiàn)為局部組織的青紫、瘀斑、腫脹、疼痛[3]。軟組織損傷在中醫(yī)學(xué)屬傷筋范疇，主要病機(jī)為血瘀氣滯，脈絡(luò)不和，治療當(dāng)以活血化瘀、消腫止痛為主[4]。急性軟組織損傷處常因出血、局部組織缺血或缺氧導(dǎo)致無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，激發(fā)炎癥介質(zhì)和促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放，引起血管壁通透性改變和血管收縮，組織液在組織間隙大量聚集，從而引起水腫、疼痛，毛細(xì)血管的破裂也會(huì)導(dǎo)致皮膚下出現(xiàn)青紫和瘀斑。

急性軟組織損傷的治療主要包括外治和內(nèi)治，內(nèi)治中西醫(yī)主要口服非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，如阿司匹林、吲哚美辛腸溶片等，這類藥物通過(guò)抑制環(huán)氧合酶的活性，干擾花生四烯酸的代謝，從而阻斷前列腺素的生成[5-6]。這類藥也做成外用制劑使用，如吲哚美辛巴布膏、吲哚美辛凝膠等。中醫(yī)藥治療軟組織損傷有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可采用中藥、《黃帝內(nèi)經(jīng)》，發(fā)展至今有敷貼、薰洗、濕敷、搽擦等不同方法，酊劑、酒劑是常用制劑[7]。此方針灸推拿和聯(lián)合療法等。中藥外治法最早見(jiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，發(fā)展至今有敷貼、薰洗、濕敷、搽擦等不同方法，酊劑、酒劑是常用制劑[7]。此方法具有療效顯著、治療方便、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在日常的軟組織損傷治療中得到廣泛應(yīng)用。

圖1 急性軟組織損傷大鼠局部軟組織形態(tài)學(xué)HE染色圖(40×，Bar=200 μm)

TNF-α是促炎癥因子，在中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活化和趨化，黏附分子的表達(dá)等炎癥反應(yīng)中起重要作用[8]。可由激活的巨噬細(xì)胞、突觸成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生[9]，能促進(jìn)IL-1、IL-6等的產(chǎn)生，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生超氧化物，釋放出溶酶體而損傷細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)[10]；造模后血清TNF-α顯著上升，給藥后血清TNF-α水平出現(xiàn)明顯下降，且昌吉紅花酊對(duì)TNF-α的降低有更顯著的療效。

IL-10主要由激活的單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等產(chǎn)生，是機(jī)體內(nèi)重要的抑炎癥因子[11]。IL-10具有多項(xiàng)免疫調(diào)節(jié)功能，能抑制Th0、Th1、TH2等多種T細(xì)胞的分泌功能，減少使白細(xì)胞聚集的炎性因子和細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生，阻止炎癥細(xì)胞的活化和聚集，還能抑制巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活化功能，從而直接或間接抑制炎癥反應(yīng)[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組IL-10水平比空白組高，分析是機(jī)體應(yīng)對(duì)急性軟組織損傷時(shí)產(chǎn)生大量促炎癥因子所產(chǎn)生的代償反應(yīng)[13]，通過(guò)增加IL-10的釋放來(lái)減輕炎癥反應(yīng)；給藥組因給予紅花酊劑后炎癥減輕，從而代償性升高的IL-10水平降低。

血液流變性是研究血液、血細(xì)胞、血漿的流動(dòng)性和變形性以及這種特性對(duì)循環(huán)和全身功能代謝的影響。全血黏度是血液流變性的綜合反映，全血黏度增高表示血液流變性質(zhì)異常，組織血液灌流障礙[14]。軟組織損傷后，炎性物質(zhì)釋放導(dǎo)致微循環(huán)障礙，毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致血流減慢，瘀阻，纖維蛋白原含量增高，血細(xì)胞電泳時(shí)間延長(zhǎng)，血漿黏度和全血黏度增高[15]。本實(shí)驗(yàn)中，不同切變率下的全血黏度給藥組均小于模型組，表示紅花酊外用可降低急性炎癥引起的血液黏度，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看昌吉紅花比簡(jiǎn)陽(yáng)紅花作用更強(qiáng)；HE病理檢測(cè)結(jié)果表明，紅花酊劑可減輕急性損傷部位軟組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞間隙水腫，以昌吉紅花效果略好。

本實(shí)驗(yàn)顯示，昌吉紅花對(duì)軟組織損傷的治療作用較優(yōu)。紅花中化學(xué)成分主要包括黃酮類、生物堿類、聚炔類、木脂素類、有機(jī)酸類、烷基二醇類以及甾體類等化合物[16]，研究表明，紅花活血化瘀功效的主要有效物質(zhì)之一是羥基紅花黃色素A(HSYA)，是藥用紅花中起效作用最強(qiáng)的水溶性成分[17]。董文彬等[18]采用大鼠心肌缺血及血瘀模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A能明顯減少心肌缺血大鼠的心肌梗死面積，顯著減少血清肌酸激酶MB型(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的產(chǎn)生，抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集，降低心肌缺血大鼠的血液黏度，還可一定程度延長(zhǎng)血漿凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)，顯著降低大鼠血漿纖維蛋白原含量。HSYA可顯著改善血液流變學(xué)指標(biāo)，如全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞變形性和聚集性，但對(duì)紅細(xì)胞壓積無(wú)明顯影響，其作用機(jī)制可能與其抑制血栓形成、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)前列環(huán)素/血栓素(PGI2/TXA2)及改變血液流變學(xué)有關(guān)[19]。宋玉龍等[20]通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地的紅花質(zhì)量分析研究發(fā)現(xiàn)，伊犁、塔城、昌吉地區(qū)紅花的羥基紅花黃色素A含量較大為1.55%～2.32%，新疆和田、四川、云南地區(qū)紅花的羥基紅花黃色素A含量較小為1.08%～1.68%。徐山[21]研究發(fā)現(xiàn)，新疆紅花中羥基紅花黃色素A含量均值規(guī)律為昌吉州(2.42%)>塔城地區(qū)(2.18%)>伊犁地區(qū)(1.92%)，提示這可能是昌吉紅花酊劑對(duì)急性軟組織損傷大鼠的血流變和炎癥因子的改善作用優(yōu)于四川紅花的原因之一。