朱超，馬靚琛，王曼婷，馬宏瑞，趙瀾博

（1.陜西科技大學，陜西 西安 710021；2.西北工業(yè)大學，陜西 西安 710072）

引言

隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，人類活動對環(huán)境的影響不斷加劇，向環(huán)境中釋放了大量的重金屬，使得重金屬污染面積逐步擴大，污染程度不斷加深[1]。其中水溶性Cr(VI)的生物毒性是強致突變物質(zhì)，美國的環(huán)境保護機構（USEPA）已將其認定為是嚴重危害人類健康的17 種化學物質(zhì)之一[2]。相關研究還指出，高濃度Cr(III)的暴露也會對植物造成明顯的毒害作用，影響其萌發(fā)過程，甚至抑制光合作用等生理過程[3]。皮革經(jīng)過浸水、脫毛、鞣制及其他加工工段產(chǎn)生許多皮革廢液，鉻作為皮革廢水的主要污染物之一，主要存在形式為Cr(VI)和Cr(III)[4]。中國制革產(chǎn)量全球第一，據(jù)統(tǒng)計制革廢水年排放量約為1.38億噸，其中總鉻排放量在6.7 t 左右，在我國各類行業(yè)造成的Cr 污染中，制革行業(yè)占比超過40%[5-6]，潛在環(huán)境健康風險較大[7]。

目前，含鉻廢水的治理方法主要有物理法[8]、化學法[9]和生物法[10]。物理法包括離子交換法，吸附法，膜分離法等[11]?；瘜W法包括還原沉淀法、電解法和光催化還原法等，但都存在一定的局限性。近年來，由于生物法[12]具有經(jīng)濟高效、作用溫度低、pH 適應范圍寬、污泥量少、無二次污染[13]等優(yōu)勢，成為生物除鉻技術和機制研究熱點之一[14]。

目前關于生物除鉻的研究主要集中在利用真菌或細菌對Cr(VI)進行吸附和還原[15]。王瑜謙[16]在高濃度鉻污泥中得到的五種優(yōu)勢菌株在70 h 內(nèi)對Cr(VI)（600 mg/L）的還原性可達80%以上[17]。王巖等[18]以浮游藻類制成的生物吸附劑在3 h 時對Cr(VI)的吸附可達92.10%。生物法治鉻的主要核心在于耐鉻機制的研究上，現(xiàn)有研究[19]表明當Cr(III)濃度低于10 mg/L 時，對普通小球藻細胞抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD、CAT、POD 表現(xiàn)為促進作用，大于10 mg/L 時具有抑制作用。陳蘭等[20]發(fā)現(xiàn)長根菇菌絲體對Pb(II)和Cd(II)的耐受能力分別為400 mg/L 和16 mg/L，其中SOD 和CAT 的活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢。相關研究發(fā)現(xiàn)其他重金屬脅迫初期，黃孢原毛平革菌抗氧化酶系中的SOD 優(yōu)先響應，其次是CAT 和GSH-Px[21]。

目前基于抗氧化酶系響應研究微生物耐受高濃度鉻的機制研究主要集中在細菌和植物上[22]，對于真菌的耐鉻機制研究幾乎沒有，但真菌是制革含鉻廢水生物處理系統(tǒng)中的常見菌種，將其用于廢水中Cr(VI)和Cr(III)的去除很有潛力，故闡明真菌的耐鉻機制對優(yōu)化其應用技術研發(fā)具有重要意義[23]。

本研究擬直接從高濃度鉻液中分離鑒定耐受高濃度鉻真菌，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并研究其基于抗氧化酶系的耐受機制, 為應用此類菌種進行含鉻廢水處理或制備重金屬鉻吸附劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗菌種取自實驗室被真菌污染的質(zhì)量濃度為100 mg/L Cr-EDTA 溶液。

蛋白胨、葡萄糖、瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司；總抗氧化能力測試盒、總超氧化物歧化酶測試盒、過氧化氫測試盒、蛋白質(zhì)測試盒，南京建成生物工程研究所。

ICP，美國THEM 公司；能譜儀，EDAX Octane Prime 公司；Multiskan FC 型酶標儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

液體培養(yǎng)基采用改良馬丁培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母浸出粉2 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g；固體培養(yǎng)基采用改良馬丁培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母浸出粉2 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂2%。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的分離培養(yǎng)

配制液體培養(yǎng)基，根據(jù)微生物實驗方法，將培養(yǎng)基以及所需儀器進行分裝滅菌。于超凈工作臺中，從真菌污染的100 mg/L 1∶1 Cr-EDTA 溶液中分離提取真菌菌株。將真菌用接種環(huán)挑出，分別放入三個裝有100 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中進行擴繁，150 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)成功后，于4 ℃保存，作為接種物備用。

1.2.2 真菌的理化性質(zhì)研究

觀察生長出的菌株，肉眼觀察菌株的特征，利用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子梗、分生孢子等形態(tài)特征，根據(jù)其菌落特征以及形態(tài)特征進行菌種的初步鑒定。

分別在培養(yǎng)溫度為26，28，30，32，34 ℃時，培養(yǎng)真菌，研究溫度對其生長影響，并確定最適生長溫度。配制液體培養(yǎng)基，在加熱狀態(tài)下調(diào)節(jié)pH 分別為4，5，6，7，8，9，在培養(yǎng)皿分別培養(yǎng)真菌，研究pH對其生長影響，確定最適生長pH。根據(jù)確定的最適生長溫度以及最適生長pH，進行其他因素對菌株生長的影響的研究。

1.2.3 菌株的分子生物學鑒定

液體擴培的菌體經(jīng)1500 r/min 離心5 min 收集后，采用TSINGKE 植物DNA 提取試劑盒（通用型）進行基因組DNA 的提取，并由北京擎科生物科技有限公司進行18s rRNA 基因測序，所得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行blast 比對分析，獲得具有同源序列的菌株信息，下載相關參比序列，以Aspergillus flavus 為外類群，運用MEGA 5 軟件通過鄰接法（Join-neighbor）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 檢測設置為1000 次重復。

1.2.4 菌種的耐鉻濃度梯度實驗

（1）Cr(VI)標準溶液的配置

稱取重鉻酸鉀2.835 g，蒸餾水定容至1000 mL，則該溶液中Cr(VI)的最終質(zhì)量濃度是1 g/L，準確吸取1 g/L 的Cr(VI)標準溶液1,2,3,4,5 mL 分別置于250 mL 的三角瓶中，加液體培養(yǎng)基稀釋至100 mL，即可得到Cr(VI)質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50 mg/L 的培養(yǎng)基，同理配制Cr (VI) 質(zhì)量濃度為60，70，80，90，100 mg/L；200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L；2000，3000，4000，5000 mg/L 的培養(yǎng)基。

（2）菌種的馴化

將配制好的培養(yǎng)基以及所需儀器進行分裝滅菌，使用接種環(huán)將培育出的母種分別接種到配制好的低濃度鉻的液體培養(yǎng)基中，150 r/min 30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)完成后置于冰箱4 ℃保存。

（3）耐鉻濃度梯度實驗

將配制好的培養(yǎng)基以及所需儀器進行滅菌，將培育出的母種分別接種到配制好的液體培養(yǎng)基中，150 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，根據(jù)菌株生長情況確定菌株的最高耐鉻能力。

1.3 分析方法

使用測試盒分別測試T-AOC，T-SOD，CAT，嚴格按照測試盒要求進行測試，根據(jù)各自所需波長下得到的OD 值，計算出菌株的主要抗氧化酶。

COD 的測定嚴格按照測試盒操作表使用各試劑，于波長550 nm 處，1 cm 光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，比色，根據(jù)測定的結果由式1 求出總抗氧化能力。

總抗氧化能力（U/mgprot）=（（測定OD 值- 對照OD 值）÷0.01））÷30×（（反應液總量（mL）÷（取樣量（mL）÷蛋白濃度（mgprot/mL）） （1）

T-SOD 的測定嚴格按照測試盒操作表使用各試劑，于波長550 nm 處，1 cm 光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，比色，根據(jù)測定的結果由式2 求出總SOD 活力。

總SOD 活力（U/mgprot）=（（對照OD 值- 測定OD 值）÷對照OD 值）÷50%×（（反應液總體積（mL）÷（取樣量（mL））÷待測樣蛋白濃度（mgprot/mL）（2）

CAT 嚴格按照測試盒操作表使用各試劑，于波長405 nm 處，1 cm 光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值，根據(jù)測定的結果由式3 求出CAT 活力。

CAT 活力（mmol/mgprot）=（（測定OD 值-空白OD 值）÷（標準OD 值-空白OD 值））×標準品濃度（163 mmol/L）×（1÷蛋白濃度（gprot/L）） （3）

蛋白濃度嚴格按照測試盒操作表使用各試劑，于波長550 nm 處，1 cm 光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，比色，根據(jù)測定的結果由式4 求出蛋白濃度。

待測樣品蛋白濃度（g/L）=（（測定OD 值-空白OD 值）÷（標準OD 值-空白OD 值））×標準品濃度（0.563 g/L） （4）

1.3.1 基于抗氧化酶的耐鉻機制的研究

根據(jù)T-SOD，T-AOC，CAT，蛋白質(zhì)的測試結果，進行線性擬合，分析出菌株的綜合抗氧化能力，根據(jù)抗氧化酶活性和Cr(VI)的劑量效應關系，分析其耐鉻機制，并通過暴露脅迫去除后培養(yǎng)實驗，研究分離菌株的最大Cr(VI)耐受濃度。

1.3.2 菌株對Cr(VI)的吸收量

使用等離子電感耦合原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES，陜西科技大學輕工學院），測定1000 mg/L Cr(VI)暴露72 h 后，剩余的Cr(VI)濃度，并基于250 mL 培養(yǎng)體系計算溶解態(tài)鉻的百分比，同時使用環(huán)境掃描電子顯微鏡（分別在1500 kv 和1000 kv 發(fā)射電壓；放大倍數(shù)3000 倍和4000 倍下觀察）觀察真菌形態(tài)，并配合能譜儀掃描測定菌體表面Cr 質(zhì)量百分比作為吸附態(tài)Cr 濃度，依據(jù)培養(yǎng)體系中真菌總干重計算吸附態(tài)Cr 總量及占培養(yǎng)體系總鉻的百分比，其余占比部分的鉻則推定為進入真菌細胞內(nèi)部的鉻。

2 結果與討論

2.1 菌株的理化性質(zhì)

2.1.1 菌落特征

菌株的形態(tài)學鑒定如圖1a，1b 所示。在固體培養(yǎng)基中上呈現(xiàn)肉眼可見的絨毛狀菌體，菌株形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，白色，呈現(xiàn)或松或緊的形狀，菌落和培養(yǎng)基間緊密連接，不易挑取，菌落正面為白色，背面為棕紅色。

圖1 菌株形貌觀察（a 為菌體正面形態(tài)，b 為菌體背面形態(tài)，c 為分離菌株上浮菌體電子顯微鏡形貌圖，d 為為下棲菌體電子顯微鏡形貌圖，e 為分離菌株Cr1000 光學顯微鏡照片200×）Fig. 1 Morphology observation of strain(a is the front morphology of bacteria,b is the back morphology of bacteria,c is the electron microscope morphology of floating bacteria,d is the electron microscope morphology of benthic bacteria,e is the optical microscope photograph of isolated strain Cr1000 200×)

在液體培養(yǎng)基中，白色菌體上浮連成片，不易分開，不透明狀孢子下沉，部分白色菌絲附著于瓶壁，上浮菌體和下棲菌體電子顯微鏡照片見圖1c和1d，分離株光學顯微鏡觀察結果分別見圖1e,由圖可知上浮菌體為氣生菌絲構成的較致密的膜形態(tài)，下棲菌體則為基底菌絲和包子囊形成的復合體，光學顯微鏡顯示分離株孢子囊在分枝的孢子囊梗上發(fā)育，孢子囊著生在彎曲的錐形分生孢子梗的頂端，具有典型的霜霉屬特點，這與分子生物學鑒定的結果相一致。

2.1.2 分子生物學鑒定

圖2 為基于分離株18s rRNA 基因序列比對構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，由進化距離和分簇信息可知，分離株Cr1000 和已報道的Peronospora meconopsidis 高度同源，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫比對可知分離株Cr1000 同Peronospora meconopsidis18s rRNA 基因序列（登錄號：KU948930.1）相似度為99.5%，可以確定本研究所得真菌分離株為霜霉屬，有研究表明該菌株可通過一般抗性機制、生物吸附和流出機制處理重金屬[24]。

圖2 分離株Cr1000 系統(tǒng)發(fā)育進化Fig.2 Phylogenetic tree of Cr1000 isolated strain

2.1.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

根據(jù)實驗結果得知，該菌株的最高耐鉻質(zhì)量濃度為1000 mg/L、在轉(zhuǎn)速為150 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)72 h、最適培養(yǎng)溫度為30 ℃、最適培養(yǎng)pH 為6。

2.2 菌株對Cr(VI)的吸附

以Cr1000 菌株（培養(yǎng)基含Cr (VI) 質(zhì)量濃度為1000 mg/L 的菌株）為例，根據(jù)ICP-AES 測定結果（圖3）可知，Cr1000 菌株培養(yǎng)液中剩余鉻質(zhì)量分數(shù)為26.4%，而Cr1000 菌體表面吸附鉻量占菌體生物量約為33%，換算為培養(yǎng)體系中總鉻質(zhì)量分數(shù)24.3%，可推算Cr1000 菌體吸收的鉻占比約為49.3%，說明該菌株有作為重金屬鉻活性吸附劑的價值。

圖3 培養(yǎng)液中剩余Cr(VI)質(zhì)量分數(shù)Fig. 3 Percentage of the residual Cr(VI) concentration in culture medium

2.3 抗氧化酶的耐鉻機制

2.3.1 六價鉻濃度與抗氧化酶系活性關系

圖4 為不同Cr(VI)濃度下分離株抗氧化酶系活性的變化特征。

正常情況下，生物體內(nèi)會存在一套完整的抗氧化體系清除自由基，使細胞內(nèi)的自由基維持在適當水平，維持細胞的氧化還原平衡狀態(tài)，但是當細胞遭遇逆境脅迫時，細胞內(nèi)活性氧水平可能急劇上升，其產(chǎn)生速度可能超出了細胞平衡狀態(tài)下的清除能力，造成細胞的氧化損傷。微生物體內(nèi)活性氧的清除主要由某些酶系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)來完成，其中T-AOC、T-SOD、CAT 是最重要的活性氧清除酶系統(tǒng)，SOD 將O2-歧化成H2O2，再由CAT 將H2O2分解成H2O 和O2，T-AOC 則為生物細胞整體抗氧化性的評價指標。

由圖4 可知，在不同Cr(VI)濃度暴露情況下，分離株的T-AOC、T-SOD、CAT 的活性較之對照均顯著增加，其中T-SOD 活性增速最快，在Cr(VI)質(zhì)量濃度為155 mg/L 時可達到空白對照組的4 倍，CAT為對照組的3.8 倍，T-AOC 是為對照組的2 倍；當鉻質(zhì)量濃度范圍在155～750 mg/L 時表現(xiàn)為緩慢增長，當質(zhì)量濃度范圍大于750 mg/L 是時，T-AOC 活力進入平穩(wěn)期，但T-SOD、CAT 活力仍處于增長期。試驗結果肯定了Cr(VI)暴露下該分離株可通過抗氧化系統(tǒng)的應激反應來平衡Cr(VI)導致的氧化脅迫。

圖4 Cr(VI)濃度與抗氧化酶活性響應圖Fig.4 Responding variation of the activities of antioxidant enzymes to different Cr(VI) concentrations

2.3.2 各抗氧化酶之間的關系

根據(jù)各抗氧化酶的測定結果，T-AOC 與T-SOD 的關系，T-AOC 與CAT 的關系，T-SOD 與CAT 的關系如圖5。

由圖5a 可得，隨著T-SOD 越高，菌株的總抗氧化能力越強，進行線性擬合，各參數(shù)如圖5a，關系見公式5。

總抗氧化能力（U/mgprot）=0.204×總SOD 活力（U/mgprot）-0.535 （5）

根據(jù)T-AOC 與H2O2的測定結果，T-AOC 與CAT 的關系如圖5b。

由圖可得，隨著CAT 越高，菌株的總抗氧化能力越強，進行線性擬合，各參數(shù)如圖5b，關系見公式6。

圖5 各抗氧化酶系之間的關系（a.T-AOC 與T-SOD 的關系，b.T-AOC 與CAT 的關系C.T-SOD 與CAT 的關系）Fig. 5 Relationship between antioxidant enzymes(a.Relationship between T-AOC and T-SOD,;b.Relationship between T-AOC and CAT;C.Relationship between T-SOD and CAT)

總 抗 氧 化 能 力（U/mgprot）=0.1942 ×H2O2（U/mgprot）+1.7782 （6）

根據(jù)T-SOD 與CAT 的測定結果，T-SOD 與H2O2的關系如圖5c。

由圖可得，隨著CAT 越高，菌株的總抗氧化能力越強，進行線性擬合，各參數(shù)如圖5c，關系見公式7。

總SOD 活力（U/mgprot）=0.9686×H2O2（U/mgprot）-7.945 （7）

3 結論

（1）該分離株為霜霉菌菌屬，為好氧生長，能在較寬的pH 值（4～9）和溫度（25～35 ℃）范圍內(nèi)生長，生長最適環(huán)境條件為150 r/min 震蕩，pH=7，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

（2）重鉻酸鉀質(zhì)量濃度為50～1000 mg/L 時，菌株生長隨Cr (VI) 濃度升高受抑制情況逐漸增強，1000～5000 mg/L 時，菌株生長受到顯著抑制，基本不生長，轉(zhuǎn)移到不含鉻培養(yǎng)基時，3000 mg/L 鉻暴露下的菌株又重新生長，因此該菌的最高耐鉻質(zhì)量濃度為3000 mg/L。

（3）培養(yǎng)液濃度分別與抗氧化酶活性(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過氧化氫酶(CAT)呈正相關，且活性增速從高到低為T-SOD、CAT、T-AOC，說明本菌對于鉻的抗性是由抗氧化酶系協(xié)同作用的結果；抗氧化酶活性(T-AOC)與總超氧化物歧化酶(T-SOD)、抗氧化酶活性(T-AOC)與過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)與過氧化氫酶(CAT)也分別呈線性正相關。