程玉林,李國(guó)英*

（1.四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610065；2.四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）

前言

膠原水凝膠具有良好的生物相容性、低免疫原性和可生物降解性，且膠原分子含有特定的氨基酸殘基和序列能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)，因此廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1-3]。膠原水凝膠的制備通常是用5 mg/mL 膠原溶液在37 ℃下培養(yǎng)3 h 自組裝成膠，且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，在1 Hz 時(shí)儲(chǔ)能模量?jī)H90.57 Pa，損耗模量?jī)H12.25 Pa。膠原水凝膠所需成膠時(shí)間過長(zhǎng)，還存在機(jī)械性能不足的問題，極大的限制了膠原水凝膠的臨床應(yīng)用潛力。

光固化具有無溶劑、快速節(jié)能和條件溫和的優(yōu)點(diǎn)[5]，且可對(duì)水凝膠的形成過程進(jìn)行控制，開發(fā)性能和結(jié)構(gòu)皆可調(diào)節(jié)的水凝膠[6]。目前制備膠原基光固化水凝膠多使用丙烯酸類修飾膠原，如Ke Yang 等[7]通過膠原甲基丙烯酰胺制備光固化水凝膠并用于軟骨再生。但丙烯酸只能從石油化工原料中獲得，具有刺激性和過敏性[8]，還有一定的毒性[9]。

衣康酸是含有一個(gè)碳碳不飽和雙鍵的二元酸，且可通過真菌發(fā)酵獲得[10]，是一種光固化材料中丙烯酸的生物基替代品[11]，主要在添加劑和橡膠涂層等領(lǐng)域，用于制備生物基助劑[12]和開發(fā)環(huán)保光固化涂料[13]，衣康酸制備光固化水凝膠的報(bào)道尚很欠缺。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，衣康酸是抗菌代謝物和免疫細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)物[14-15]，具有生物相容性、可生物降解性、抗菌性[16]、抗炎性[17-18]和藥物緩釋能力[19]。這些優(yōu)異的生物性能標(biāo)示著衣康酸在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有巨大的潛力。S.Potorac 等人[20]制備了單衣康酸基團(tuán)的改性膠原，并添加N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和過硫酸銨與甲基丙烯酸2-羥乙酯共聚24 h 制備了半互穿網(wǎng)絡(luò)，并指出該支架可用于組織工程，反應(yīng)所用交聯(lián)劑毒性較大，耗時(shí)長(zhǎng)。鑒于此，本文擬用衣康酸改性膠原并通過光固化快速制備水凝膠。

由于酸酐反應(yīng)活性更高，本工作選用衣康酸酐改性膠原，通過具有細(xì)胞相容性的光引發(fā)劑引發(fā)碳碳雙鍵的自由基聚合[21-22]，使聚合物溶解度降低，并形成網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，最終喪失流動(dòng)性而形成凝膠[23-24]，成膠示意圖如圖1。制備了不同取代度形成的光固化水凝膠以探究取代度對(duì)光固化凝膠性能的影響，并根據(jù)其性能評(píng)價(jià)了光固化水凝膠在傷口敷料中的潛在應(yīng)用前景，且為實(shí)現(xiàn)光固化凝膠性能的可調(diào)控性奠定基礎(chǔ)。

圖1 光固化水凝膠形成機(jī)理Fig.1 Schematic of the photocurable hydrogel formation

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

凍干牛皮膠原，實(shí)驗(yàn)室自制；衣康酸酐（98%+），阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；三硝基苯磺酸（TNBS），Sigma 公司；Irgacure 2959（98%），Aldrich 化學(xué)試劑公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

TU-1900 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，普析通用儀器有限責(zé)任公司；Nicolet iS10 傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；MCR 流變儀，安東帕公司；FD-1A-50 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 膠原的改性

稱取1.5 g 膠原溶解于500 mL 的磷酸緩沖液（pH 值7.4），加入10 mL 衣康酸酐丙酮溶液在0～10℃下持續(xù)攪拌24 h 后，用截留相對(duì)分子質(zhì)量為8～14 KD 的透析袋在去離子中水透析三天后冷凍干燥得到可光固化膠原。其中，膠原分子的自由氨基（牛皮膠原每1000 個(gè)氨基殘基含33 個(gè)賴氨酸和羥賴氨酸殘基[25]）與衣康酸酐物質(zhì)的量比分別為1∶10、1∶30、1∶50、1∶70 和1∶90，制備得到的樣品依次記為A、B、C、D 和E。

1.3 可光固化膠原的表征

1.3.1 取代度測(cè)定

通過三硝基苯磺酸（TNBS）法[26]測(cè)定膠原游離氨基的取代程度，具體方法為：將牛皮膠原與可光固化膠原分別溶解在0.01 mol/L 的鹽酸溶液中配置為2 mg/mL 的溶液，取250 μL 入消解管，加入1 mL磷酸緩沖液（pH 值為8），避光加入1 mL 0.1%的TNBS 溶液，搖晃均勻后在50 ℃暗反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入2 mL 4 mol/L 的HCl 溶液，置于暗處，冷卻30 min 后測(cè)定混合液在340 nm 處吸光度（OD），并根據(jù)以下公式計(jì)算自由氨基含量：

自由氨基含量=OD可光固化膠原/OD牛皮膠原×100%

1.3.2 傅里葉紅外光譜測(cè)定

為測(cè)定可光固化膠原的結(jié)構(gòu)，將凍干的牛皮膠原和可光固化膠原海綿分別與溴化鉀研磨均勻并壓成薄片，用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)32 次。

1.4 光固化凝膠的制備

以磷酸緩沖液（pH 值7.4）為溶劑，可光固化膠原質(zhì)量濃度10 mg/mL，并加入0.2%的Irgacure 2959，充分溶解后離心脫泡得到預(yù)制液。分別稱取A～E 樣品預(yù)制液2 g 于24 孔板（孔直徑為2 cm）中，用紫外光（6 W，365 nm）照射3 min 得到光固化水凝膠，分 別 標(biāo) 記 為Gel-A、Gel-B、Gel-C、Gel-D 和Gel-E。

1.5 凝膠的成膠能力與凝膠形貌測(cè)定

1.5.1 膠凝時(shí)間測(cè)定

稱取1 g 凝膠預(yù)制液于3 mL 取樣瓶中，置于紫外光源下照射，利用傾斜法測(cè)定并記錄不同官能化程度的可光固化膠原樣品的凝膠時(shí)間。

1.5.2 凝膠的形貌觀察

將凍干后的光固化水凝膠噴金處理后，在加速電壓20 kV 下通過電子顯微鏡觀察樣品的形貌。

1.6 凝膠的流變測(cè)量

使用流變儀測(cè)定水凝膠的機(jī)械性能，將待測(cè)水凝膠放至流變儀的不銹鋼平行板（直徑20 cm）上，設(shè)置板間間隙2 mm，在溫度為20 ℃，應(yīng)變?yōu)?%的條件下，進(jìn)行動(dòng)態(tài)頻率掃描，記錄頻率范圍為0.01～10 Hz 的儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G'''）。

1.7 凝膠的溶脹性能

水凝膠的溶脹比在37 ℃條件下測(cè)定，將凍干的凝膠海綿稱重后浸泡在20 mL 磷酸緩沖液（pH值6.5），每2 h 對(duì)凝膠稱量，直到凝膠重量不變，每個(gè)樣品進(jìn)行三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)公式（1）計(jì)算溶脹度后取平均值：

溶脹度=W凝膠/W海綿-1 （1）

1.8 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

選取金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（E.coli）驗(yàn)證不同樣品的抗菌特性，具體操作為：取10 μL 菌液（1×107cfu/mL）于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，涂布均勻，將水凝膠（高度=5 mm，直徑=10 mm）紫外殺菌30 min 后放置在平板中央，在37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑制區(qū)域直徑。用未添加水凝膠的瓊脂板作為空白對(duì)照組，且每個(gè)樣品進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算抑制區(qū)的平均直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸酐用量對(duì)自由氨基含量的影響

衣康酸酐主要與膠原側(cè)鏈上的ε- 氨基發(fā)生?；磻?yīng)[27]，氨基作為親核基團(tuán)進(jìn)攻酸酐中羰基的碳原子形成酰胺鍵與羧基，而衣康酸酐分子中1 號(hào)與2 號(hào)碳原子存在p-Π 共軛，因此氨基更傾向于攻擊4 號(hào)碳原子，主要反應(yīng)原理見圖1。圖2 為自由氨基含量隨衣康酸酐用量的變化關(guān)系。如圖2 所示，樣品A～E 的自由氨基含量分別89.5%、43.0%、29.6%、22.9%和17.2%，即其取代度分別為10.5%、57.0%、70.4%、77.1%和82.8%。隨著衣康酸酐用量增加，自由氨基含量減少，直到自由氨基與衣康酸酐物質(zhì)的量比為1∶50 自由氨基含量下降趨勢(shì)明顯減緩。因?yàn)槭茏杂砂被偭肯拗?，?dāng)衣康酸酐用量增加到一定程度后，能參加反應(yīng)的自由氨基數(shù)量減少，自由氨基含量下降趨勢(shì)減緩，這初步說明成功在膠原側(cè)鏈上接枝了衣康酸基團(tuán)。

圖2 牛皮膠原（Col）與可光固化膠原（A、B、C、D 和E）自由氨基含量Fig.2 Free amino content of bovine collagen (Col) and photocurable collagen (A, B, C, D and E)

2.2 可光固化膠原的紅外光譜分析

紅外光譜中酰胺Ⅲ帶與1450 cm-1處的吸收率（A）比值可評(píng)價(jià)膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)完整性[28-29]，明膠的比值僅為0.59，而膠原的比值遠(yuǎn)高于明膠[30]。牛皮膠原及可光固化膠原的紅外光譜圖如圖3，Col 與A～E 的A 酰 胺Ⅲ/A1450 值 依 次 為0.996、0.806、0.821、0.863、0.863 和0.875，比值均大于0.59，說明可光固化膠原保留了一定程度的三股螺旋結(jié)構(gòu)。相比于牛皮膠原紅外光譜，官能化膠原的光譜在3432 cm-1附近的吸收峰發(fā)生略微紅移，且波峰變寬，這是因?yàn)橐驴邓狒牧税被?，生成了酰胺鍵，故而氨基中伯胺中N-H 的伸縮震動(dòng)（3440 cm-1附近）減弱，而仲酰胺N-H 伸縮震動(dòng)（3300 cm-1附近）增強(qiáng)；同時(shí)，1405 cm-1處峰吸收強(qiáng)度明顯增加，這歸因于CH2=CR1R2結(jié)構(gòu)中C-H 鍵的彎曲振動(dòng)[31]。紅外圖譜的這些變化進(jìn)一步證明衣康酸酐成功的接枝到膠原上，得到了可光固化膠原。

圖3 牛皮膠原與可光固化膠原的紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of Col and photocurable collagen

2.3 光固化凝膠的成膠能力與形態(tài)表征

多孔結(jié)構(gòu)敷料非常有利于吸收分泌物和保持水分，光固化凝膠的實(shí)物圖與微觀結(jié)構(gòu)圖如圖4 所示，結(jié)果顯示，所有樣品都能在180 s 內(nèi)快速成膠，Gel-A、Gel-B、Gel-C、Gel-D 和Gel-E 的平均孔徑分別為1.25、1.12、0.89、0.74 和0.44 mm，可見，隨著取代度增加，凝膠固化所需時(shí)間變長(zhǎng)，同時(shí)凝膠孔徑逐漸變小。因?yàn)橹饾u凝膠化使鏈段移動(dòng)性降低，只能與臨近位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)，且可光固化膠原分子內(nèi)存在的大量游離羧基還會(huì)產(chǎn)生排斥而不利于固化反應(yīng)[32]；另一方面，羧基使可光固化膠原溶解度增加而難以形成凝膠。而取代度增加導(dǎo)致反應(yīng)位點(diǎn)變多，凝膠的交聯(lián)度變大從而獲得了更小孔徑也更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)。因此，可以通過調(diào)節(jié)膠原與酸酐的比例來調(diào)整可光固化膠原的成膠能力與凝膠孔徑結(jié)構(gòu)。

圖4 光固化凝膠的宏觀照片（左）和放大倍數(shù)為20 的SEM圖像（右）（對(duì)應(yīng)可光固化膠原的取代度：Gel-A=10.5%；Gel-B=57.0%；Gel-C=70.4%；Gel-D=77.1%；Gel-E=82.8%，下同）Fig.4 Macro photos (left) and SEM images with magnification of 20 (right) of the photocurable hydrogel(corresponding substitution degree of photocurable collagen:GEL-A=10.5%;Gel-B=57.0%;GEL-C=70.4%,Gel-D=77.1%;gel-E=82.8%,the same below)

2.4 凝膠的力學(xué)性能

傷口敷料通常需要一定的強(qiáng)度和柔韌性，圖5顯示了光固化凝膠的動(dòng)態(tài)流變測(cè)量曲線。儲(chǔ)能模量和損耗模量分別反映了聚合物的彈性與粘性特性的耗散能量[33]。在頻率低于1 Hz 時(shí)，每個(gè)樣品的儲(chǔ)能模量與損耗模量都變化不大，說明樣品在0.01～1 Hz 范圍內(nèi)機(jī)械性能穩(wěn)定；同時(shí)儲(chǔ)能模量明顯大于損耗模量，說明樣品具有彈性性質(zhì)。相對(duì)于不同取代度可光固化膠原制備的光固化凝膠，其儲(chǔ)能模量與損耗模量都先增加后減小，樣品Gel-C 的儲(chǔ)能模量與損耗模量最大，其抵抗形變與流動(dòng)的能力最強(qiáng)。Gel-D 與Gel-E 的儲(chǔ)能模量與彈性模量下降，主要是因?yàn)榫酆衔镏恤然蛊淙芙舛仍黾?，交?lián)固化作用小于溶解流動(dòng)作用。

圖5 光固化凝膠的力學(xué)性能（a）儲(chǔ)能模量（G’）、（b）損耗模量（G’’）和（c）損耗角正切值（tanθ）與頻率的函數(shù)Fig.5 Mechanical properties of photocurable hydrogel(a)Storage modulus(G'),(b)loss modulus(G")and(c)loss tangent(tan θ)as a function of frequency

頻率為1 Hz 時(shí)凝膠的儲(chǔ)能模量、損耗模量和損耗角正切值見表1。在1 Hz 時(shí)，Gel-C 的儲(chǔ)能模量為358.07 Pa，損耗模量為45.93 Pa，分別為膠原水凝膠[4]的3.95 和3.75 倍。Gel-C 相對(duì)于Gel-A 的儲(chǔ)能模量與彈性模量分別增加了1.80 與1.26 倍，儲(chǔ)能模量變化大于彈性模量，說明光固化反應(yīng)對(duì)于凝膠彈性影響更大。損耗角正切值（tanθ）為損耗模量與儲(chǔ)能模量的比值，該值大于1時(shí)表示主要為粘性行為（類似于液體），該值小于1時(shí)主要為彈性行為（類似于固體）[34]，表1 中所有樣品的損耗角正切值小于0.19，表明凝膠具有較好的彈性。在所有樣品中，Gel-C 的tanθ數(shù)值最小，彈性最好且強(qiáng)度高，有利于保護(hù)傷口不受外力傷害。

表1 頻率為1 Hz 時(shí)儲(chǔ)能模量（G'）、損耗模量（G''）和損耗角正切（tanθ）的數(shù)值Tab.1 Values of storage modulus (G'), loss modulus (G'')and loss tangent (tanθ) at a frequency of 1 Hz

2.5 凝膠的溶脹分析

通常人類的體溫為37 ℃，皮膚pH 值在6.5 左右，光固化凝膠在該條件下的溶脹情況如圖6 所示。光固化凝膠的溶脹主要?dú)w因于羧基，羧基在pH值低于或高于等電點(diǎn)時(shí)分別呈正電和負(fù)電性，使凝膠快速吸水，但吸水至一定程度時(shí)會(huì)受到凝膠孔隙的制約，因而最終達(dá)到溶脹平衡。結(jié)果顯示，所有凝膠在前期快速溶脹，且在溶脹4 h 后趨于平衡，不同交聯(lián)度的凝膠溶脹性能先增加后減小。說明在一定取代度范圍內(nèi)，光固化凝膠的溶脹性隨著衣康酸基團(tuán)取代度升高而明顯增加但交聯(lián)過于致密反而會(huì)使溶脹性能降低。溶脹24 h 后，質(zhì)量體積濃度5%的明膠甲基丙烯酰胺光交聯(lián)水凝膠的溶脹率為15 左右[35-36]，而Gel-C 的溶脹率高達(dá)37.65，吸水能力強(qiáng)，有利于吸收傷口滲出液[37]。

圖6 光固化凝膠在磷酸緩沖液中的溶脹情況（a）溶脹度與時(shí)間的曲線；（b）凝膠24 h 后的溶脹度Fig.6 Swelling of photocured hydrogel in phosphate buffer(a)Curve of swelling degree versus time;(b)Swelling degree after 24 h

2.6 體外抗菌性能分析

傷口敷料需要具備一定的抗菌能力。陰離子聚合物殺菌機(jī)理是聚合物的負(fù)電荷趨使聚合物中疏水部分靠近細(xì)菌[38]，進(jìn)而通過疏水作用擾動(dòng)和破壞細(xì)胞膜而起到殺菌作用[39]。衣康酸基團(tuán)使光固化凝膠具有陰電性，為驗(yàn)證其抗菌性能，測(cè)量了光固化凝膠的抑菌圈直徑，結(jié)果如圖7。光固化凝膠交聯(lián)度越高，對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）抑菌圈直徑越大，而凝膠對(duì)大腸桿菌（E.coli）未顯示出抑制效果。因?yàn)橐志Чc衣康酸含量呈正相關(guān)[40]，且S.aureus和E.coli 的細(xì)胞壁不同，E.coli 含外壁膜和肽聚糖內(nèi)層，而S.aureus 的僅有多孔肽聚糖層，使疏水片段更容易插入[41]。

圖7 光固化凝膠的抑菌圈直徑Fig.7 Diameter of bacteriostatic zone of photocurable hydrogel

3 結(jié)論

通過調(diào)節(jié)衣康酸基團(tuán)的取代度，可以調(diào)節(jié)光固化凝膠性能：隨著衣康酸基團(tuán)取代度增加，光固化凝膠的交聯(lián)度增加，孔徑變??；凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量與溶脹性隨交聯(lián)度增加先增加后減少，抗菌性與衣康酸基團(tuán)含量呈正相關(guān)。綜合性能最佳的光固化凝膠為Gel-C，此時(shí)凝膠自由氨基含量為29.6%（即取代度為70.4%），儲(chǔ)能模量和損耗模量分別為358.07 Pa 和45.93 Pa，且溶脹率高達(dá)37.65。該光固化凝膠可快速成膠，且擁有高溶脹性和一定的抗菌性，有望用于制備傷口敷料。