謝南昌， 于曉夢， 王曉藝， 杜麗媛， 劉鳳霞， 張婉婉， 連亞軍

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中約30%患者盡管予以合理的藥物治療，仍反復(fù)發(fā)作，稱為藥物難治性癲癇，因此明確癲癇的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)尤為重要[1]。近年來研究表明線粒體功能障礙可能是癲癇的核心發(fā)病機(jī)制[2]。線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(mitochondrial unfolded protein response，mtUPR)是指在應(yīng)激條件下，各種錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在線粒體內(nèi)聚集，線粒體為了維持自身蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)而啟動(dòng)的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，即通過啟動(dòng)由核 DNA 編碼線粒體伴侶蛋白(如HSP60)和蛋白酶(如CLpP)等基因群轉(zhuǎn)錄活化，誘導(dǎo)其相關(guān)蛋白表達(dá)增加以恢復(fù)線粒體功能[3]。適度的mtUPR可以促進(jìn)線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，是早期發(fā)生的線粒體保護(hù)反應(yīng)，而過度的mtUPR則會(huì)通過HSP60調(diào)控的PINK1/Parkin途徑引發(fā)過度線粒體自噬，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。

線粒體是活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的主要場所，癲癇發(fā)作導(dǎo)致線粒體功能受損使ROS生成增加，線粒體膜電位降低，線粒體鈣超載進(jìn)而氧化應(yīng)激過度發(fā)生，誘導(dǎo)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，在線粒體內(nèi)錯(cuò)誤折疊和聚合，從而激活mtUPR[5]。Mito-TEMPO是一種線粒體靶向超氧化物歧化酶，具有清除超氧化物和烷基自由基的能力，可以減少線粒體ROS生成，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，改善細(xì)胞氧化損傷[6]。已有研究表明Mito-TEMPO可減輕脂多糖誘導(dǎo)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體氧化應(yīng)激[7]和腎纖維化中的線粒體功能障礙[8]，但Mito-TEMPO在癲癇海馬神經(jīng)損傷中的作用仍未可知。

本研究中，我們采用氯化鋰-匹魯卡品(pilocarpine，PILO)建立癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型，觀察癲癇發(fā)作過程中mtUPR的動(dòng)態(tài)變化；并進(jìn)一步探討線粒體特異性抗氧化劑(Mito-TEMPO)對(duì)癲癇mtUPR及線粒體損傷的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與造模 本次研究已經(jīng)通過鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理的批準(zhǔn)，并且按照國際動(dòng)物研究指南進(jìn)行。成年雄性Wistar鼠(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，重量在220～250 g，飼養(yǎng)溫度適宜 (20±2)℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食水，自然光照照射，自然通風(fēng)換氣。隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CON組)、致癇組(PILO組)(2 h、8 h、24 h和72 h 4個(gè)亞組)、Mito-TEMPO組和PILO + Mito-TEMPO組4組。建立大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型[9]，所有大鼠均腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)進(jìn)行預(yù)處理，20 h后給予腹腔注射東莨菪堿(1 mg/kg)以拮抗PILO的外周膽堿能反應(yīng)，30 min后予以腹腔注射PILO(30 mg/kg)。對(duì)照組用等體積的0.9%生理鹽水代替PILO。PILO+Mito-TEMPO組在PILO注射前20 min予以腹腔注射Mito-TEMPO(20 mg/kg)。按照改良后的Racine分級(jí)法判定癲癇發(fā)作等級(jí)。癲癇持續(xù)1 h后，腹腔注射地西泮(10 mg/kg)以終止發(fā)作。致癇組分別在大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后2 h、8 h、24 h和72 h后斷頭處死。

1.2 儀器與試劑 氯化鋰、匹魯卡品(Sigma，USA)；Rhodamine123 (Sigma，USA)；線粒體內(nèi)熱休克蛋白HSP60、線粒體蛋白酶LONP1、CLpP抗體 (CST，USA)；β-actin、CHOP抗體(Santa Cruz，USA)；全蛋白提取試劑盒(中國碧云天公司)；組織線粒體分離試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(北京晶美生物工程有限公司)；線粒體特異性抗氧化劑Mito-TEMPO(MedChemExpress，USA)。

1.3 分離線粒體 從海馬組織中分離出線粒體[10]。首先將取出的新鮮海馬組織快速放入預(yù)冷的分離培養(yǎng)基中(0.25 mol/L 蔗糖，10 mmol/L Tris-HCL，pH 7.4，1 mmol/L MEDTA 和250 μg /mL BSA)，徹底清洗組織，將組織制備成10%的勻漿，然后在650×g條件下離心10 min，去除細(xì)胞核和組織碎片，收集上清液然后進(jìn)一步以10000×g離心10 min。緩慢抽出上清液，用分離培養(yǎng)基清洗兩次沉淀的線粒體碎片，然后6500×g離心10 min后重新沉淀，整個(gè)過程溫度控制在0～4 ℃。然后按照說明書，并用X-rhod-1對(duì)線粒體進(jìn)行染色，在激發(fā)波長575 mm和發(fā)射波長605 mm的條件下，用分光光度計(jì)測定其熒光特性。

1.4 線粒體ROS生成水平檢測 用活性氧熒光探針(DCFDA)測定線粒體ROS生成水平[11]。將線粒體碎片(0.4 mg/L)置于DCFDA (2 μmol/L)溶液中，在25℃下孵育30 min，在激發(fā)波長485 nm和發(fā)射波長530 nm條件下測量DCA熒光，通過各單位的熒光強(qiáng)度來表示線粒體ROS生成水平。

1.5 線粒體膜電位檢測 采用Rhodamine123檢測線粒體膜電位水平。避光配置Rhodamine123工作液，向0.9 ml Rhodamine123染色工作液中加入0.1 ml總蛋白量為30 μg的純化的線粒體，37 ℃、5%CO2的孵育箱中孵育5 min。隨后10000×g離心10 min，使線粒體顆粒化，最后使用熒光顯微鏡，在激發(fā)波長507nm，發(fā)射波長529 nm條件下檢測各組熒光強(qiáng)度。

1.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 從各組完整海馬組織和線粒體碎片中提取蛋白質(zhì)，然后用BCA蛋白定量試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度[12]。在每個(gè)梳孔內(nèi)加入等量的蛋白(30μg/孔)，然后進(jìn)行SDS凝膠電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，一抗孵育，HSP60 (1∶1000)、LONP1(1∶1000)、CLpP(1∶1000)和β-actin(1∶5000)，后4 ℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗(1∶5000)，37 ℃孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，使用光密度值表示各組蛋白表達(dá)量。

1.7 透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu) 取小塊海馬組織塊，于2.5%戊二醛溶液中固定2 h，PBS浸洗15 min×3次，1%鋨酸固定2 h，PBS浸洗15 min×3次，4 ℃條件下乙醇梯度脫水，室溫丙酮脫水15 min×3次，包埋，切取海馬冠狀切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，待超薄切片干燥后，透射電鏡下觀察。

1.8 Nissl染色觀察海馬神經(jīng)元損傷 各組大鼠分別予以用10%的水合氯醛(100 mg/kg)麻醉，固定于解剖板上，用4%多聚甲醛緩灌注大鼠心腔，然后在PBS緩沖液(pH 7.4)中分離出完整大腦，分離出的各組腦組織用石蠟包埋24 h，然后冠狀切取厚度約10 μm的連續(xù)切片。按照常規(guī)方法用甲苯胺藍(lán)作Nissl染色，在高倍鏡(400×)下計(jì)算大鼠海馬CA3區(qū)存活的錐體細(xì)胞[13]。

2 結(jié) 果

2.1 癲癇海馬神經(jīng)中線粒體ROS生成和線粒體膜電位的變化及Mito-TEMPO對(duì)其影響 與CON相比，在致癇后2 h，線粒體ROS水平開始增加，72 h達(dá)到最大水平；膜電位開始降低，72 h降到最低水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PILO組相比，PILO + Mito-TEMPO組ROS水平明顯降低，線粒體膜電位明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1、圖2)。

圖1 A：各致癇組海馬神經(jīng)線粒體ROS生成變化；B：各致癇組海馬神經(jīng)元線粒體膜電位變化

圖2 A：各組海馬神經(jīng)線粒體ROS生成變化；B：各組海馬神經(jīng)元線粒體膜電位變化

2.2 癲癇海馬神經(jīng)中mtUPR相關(guān)蛋白HSP60、LONP1 和CLpP表達(dá)變化及Mito-TEMPO對(duì)其影響 與CON組相比，PILO組HSP60、LONP1、CLpP表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PILO組相比，PILO + Mito-TEMPO組HSP60、LONP1 和CLpP 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

圖3 A：致癇后海馬神經(jīng)元LONP1、CLpP和HSP60的表達(dá)水平變化；B：各組海馬神經(jīng)元LONP1、CLpP和HSP60的表達(dá)水平變化

2.3 癲癇海馬神經(jīng)線粒體超微結(jié)構(gòu)變化及Mito-TEMPO對(duì)其影響 電鏡下顯示，CON組和Mito-TEMPO組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)完整、清晰，線粒體無損傷；PILO組海馬神經(jīng)元的線粒體結(jié)構(gòu)模糊，線粒體嵴腫脹明顯，并且部分線粒體存在內(nèi)外膜的崩解；PILO + Mito-TEMPO組可見線粒體結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，內(nèi)外膜連續(xù)，線粒體嵴略腫脹，結(jié)構(gòu)尚可辨認(rèn)(見圖4)。

2.4 癲癇海馬神經(jīng)損傷及Mito-TEMPO對(duì)其影響 CON組大鼠CA3區(qū)錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)完整，排列緊密，染色稍深，胞漿內(nèi)含有豐富的尼氏小體。PILO組明顯可見海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，結(jié)構(gòu)模糊，排列稀疏，尼氏小體數(shù)量大量減少。與PILO組比較，PILO + Mito-TEMPO組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，可見大體輪廓，排列稍致密，尼氏小體數(shù)量增多。Mito-TEMPO組與CON組相比，差異不明顯(見圖5、表1)。

表1 各組大鼠海馬CA3區(qū)存活的神經(jīng)數(shù)目比較(0.5 mm)

A CON組；B PILO組；C Mito-TEMPO組；D PILO+Mito-TEMPO組

圖5 各組大鼠海馬神經(jīng)元CA3區(qū)Nissl染色(Nissl染色，×400)

3 討 論

近期研究發(fā)現(xiàn)過度的mtUPR參與應(yīng)激狀態(tài)下線粒體自噬過程，致使線粒體損傷加重，加劇細(xì)胞損傷及凋亡[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作使線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，線粒體ROS生成增加，線粒體膜電位降低，mtUPR相關(guān)蛋白HSP60、LONP1、CLpP1表達(dá)增加，表明mtUPR參與癲癇發(fā)生發(fā)展過程；而采用線粒體特異性抗氧化劑Mito-TEMPO干預(yù)，則明顯緩解mtUPR發(fā)生及線粒體結(jié)構(gòu)功能損傷，表明Mito-TEMPO可能通過調(diào)控mtUPR對(duì)癲癇海馬神經(jīng)損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

生理?xiàng)l件下，線粒體在代謝的過程中會(huì)產(chǎn)生一定量的自由基活性氧簇和活性氮簇，但是由于機(jī)體內(nèi)存在正常的抗氧化系統(tǒng)，可維持其動(dòng)態(tài)平衡[14]。如果這種平衡被打破，就可造成線粒體氧化應(yīng)激，引起一系列線粒體功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。已有研究表明氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙參與很多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如阿爾茲海默病、帕金森病等[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，PILO組線粒體ROS生成量增加，膜電位下降，提示癲癇發(fā)作時(shí)海馬神經(jīng)內(nèi)存在氧化應(yīng)激發(fā)生，并且持續(xù)性的氧化應(yīng)激可能會(huì)進(jìn)一步破壞線粒體功能，加劇癲癇發(fā)作并進(jìn)一步引起海馬神經(jīng)損傷。

mtUPR在維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[17]。目前研究表明，線粒體功能障導(dǎo)致線粒體積累并產(chǎn)生大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，引起線粒體內(nèi)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡，當(dāng)線粒體中積累了大量損傷蛋白質(zhì)，超過了線粒體中伴侶蛋白和蛋白酶處理能力時(shí)，就會(huì)觸發(fā)mtUPR[18]。本研究發(fā)現(xiàn)與CON組相比，PILO組海馬神經(jīng)中CHOP、HSP60和CLpP表達(dá)量顯著增加，提示癲癇海馬神經(jīng)中mtUPR被激活，并且過度的mtUPR會(huì)導(dǎo)致癲癇海馬神經(jīng)損傷，加重其凋亡；而線粒體特異性抗氧化劑Mito-TEMPO可降低癲癇海馬神經(jīng)線粒體ROS生成，恢復(fù)線粒體膜電位，使CHOP、HSP60和CLpP表達(dá)量下降，減輕海馬神經(jīng)元損傷，提示線粒體特異性抗氧化劑Mito-TEMPO可能通過調(diào)控mtUPR恢復(fù)部分受損的線粒體功能，對(duì)癲癇神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，PILO致癇大鼠海馬神經(jīng)中mtUPR激活，線粒體特異性抗氧化劑可能通過減少ROS生成，抑制mtUPR，從而發(fā)揮癲癇海馬神經(jīng)保護(hù)作用。本研究為癲癇的治療提供了新的治療思路。