朱俊羽， 楚 蘭， 徐 竹， 高子丹， 丹珍卓瑪

多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要特點(diǎn)的免疫性疾病，病損主要累及皮質(zhì)、近皮質(zhì)、腦室周?chē)⒁暽窠?jīng)、小腦、腦干和脊髓[1]。以20～40歲的青壯年多發(fā)，女性更常見(jiàn)[2]。MS的病因尚不明確，流行病學(xué)研究顯示MS在各地區(qū)發(fā)病率差異顯著，越接近赤道、日照時(shí)間越長(zhǎng)的地區(qū)，發(fā)病率越低，且維生素D的缺乏與MS發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)[3]。在兩項(xiàng)分別對(duì)健康對(duì)照和美國(guó)非西班牙裔白人MS患者以及瑞典MS患者的維生素D水平研究中，早期低維生素D水平是疾病活動(dòng)和進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素[4]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)是經(jīng)典的MS動(dòng)物模型[5]，目前已經(jīng)有的多項(xiàng)研究均提示1α，25-二羥基維生素D3 (1α，25-(OH)2D3，骨化三醇)能夠控制EAE的發(fā)展[6，7]，在對(duì)EAE補(bǔ)充1α，25-(OH)2D3后發(fā)現(xiàn)，鼠的神經(jīng)元凋亡損傷減少，神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理變化得到改善[8]。此外，Gargari等[9]發(fā)現(xiàn)，1α，25-(OH)2D3可使MS患者外周血單核細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-17基因下調(diào)，減緩疾病進(jìn)展。但同時(shí)也有單純使用1α，25-(OH)2D3達(dá)不到保護(hù)性作用的報(bào)道[10]。

1α，25-(OH)2D3是維生素D在體內(nèi)經(jīng)過(guò)兩次羥化后的活性代謝產(chǎn)物，與維生素D受體(Vitamin D Receptor，VDR)結(jié)合后發(fā)生磷酸化，并與維甲酸類(lèi)受體(Retinoic X Receptor，RXR)形成 1α，25-(OH)2D3-VDR-RXR 復(fù)合物。此復(fù)合物通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄程序，激活靶基因，調(diào)控整個(gè)細(xì)胞功能，分泌各種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫功能[11]。既然1α，25-(OH)2D3具有調(diào)節(jié)免疫平衡的作用，但是僅補(bǔ)充1α，25-(OH)2D3又并不能完全遏制MS的發(fā)展。因此有必要對(duì)介導(dǎo)1α，25-(OH)2D3發(fā)揮生物學(xué)作用的VDR進(jìn)行研究。本研究以EAE小鼠為對(duì)象，對(duì)比其中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域和不同神經(jīng)功能評(píng)分時(shí)VDR蛋白表達(dá)情況，期望從中找到VDR的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選擇8～10周齡的C57BL/6雌性小鼠，體重18～20 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一購(gòu)入。本次研究已通過(guò)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查(編號(hào)：1901081)。

1.2 試劑 MOG35-55多肽楚肽生物公司，弗式完全佐劑(CFA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，佐劑用卡介苗購(gòu)自石家莊開(kāi)創(chuàng)生化公司，注射用百日咳毒素購(gòu)自美國(guó)Listbio公司，Rabbit anti-VDR購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，Rabbit anti-GAPDH購(gòu)自杭州賢至公司，Goat anti-Rabbit IgG(H+L)購(gòu)自武漢普美克公司。

1.3 建立EAE動(dòng)物模型[12]MOG35-55溶液與含卡介苗的CFA等體積混勻制成抗原乳劑。用4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，在小鼠脊柱兩側(cè)以250 μg/只的劑量多點(diǎn)皮內(nèi)注射抗原乳劑。分別在免疫當(dāng)天即0 d和免疫2 d對(duì)小鼠經(jīng)腹腔注射百日咳毒素稀釋液，200 ng/只。健康對(duì)照組(n=6)小鼠不做任何處理。每日觀(guān)察并記錄小鼠飲食、活動(dòng)及體重變化，連續(xù)21 d。

1.4 評(píng)分及分組 根據(jù)Weaver’s 15分法[13]對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：尾巴可正常抬高，無(wú)無(wú)力癥狀評(píng)0分；尾巴張力減低或尾巴遠(yuǎn)端癱瘓?jiān)u1分；尾巴全癱評(píng)2分；四肢無(wú)無(wú)力癥狀或步態(tài)異常評(píng)0分；單個(gè)肢體步態(tài)不穩(wěn)、跛行評(píng)1分，單個(gè)肢體輕癱，行走有拖拽評(píng)2分，單個(gè)肢體全癱(腳掌上翻)評(píng)3分。尾巴和每個(gè)肢體累加得出總分，死亡記為15分，其中有無(wú)力癥狀表現(xiàn)，但程度不到1分的記為0.5分。評(píng)分由兩名實(shí)驗(yàn)員分別完成并記錄。

從免疫0 d開(kāi)始到21 d，神經(jīng)功能評(píng)分為0分，即為0分組(n=6)；免疫21 d神經(jīng)功能評(píng)分>0分且<6分，即為低分組(n=6)；免疫21 d神經(jīng)功能評(píng)分≥6分，即為高分組(n=6)。

1.5 透射電子顯微鏡觀(guān)察腦組織髓鞘結(jié)構(gòu) 處死小鼠后取部分腦組織，3%戊二醛固定，脫水處理后，經(jīng)高純化鉛液染色處理后在透射電子顯微鏡(FEI Tecrai G2 Spirit)下對(duì)髓鞘結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察。

1.6 Western Blot檢測(cè)組織VDR蛋白表達(dá)情況 取EAE組和健康對(duì)照組組織提蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)各組織VDR蛋白表達(dá)情況。VDR (1∶1000)，GAPDH (1∶1000)一抗4 ℃過(guò)夜，山羊抗兔IgG(1∶2000)二抗室溫孵育2 h，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶顯影后Image J統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 EAE小鼠體重及24 h食量變化情況 EAE低分組和高分組都在發(fā)病前出現(xiàn)體重下降、24 h食量下降，0分組和健康對(duì)照組體重波動(dòng)平穩(wěn)；隨著免疫天數(shù)的增加，低分組體重逐漸趨近0分組和健康對(duì)照組體重水平，高分組體重下降明顯。在免疫前期0分組24 h食量較高分組、低分組、健康對(duì)照組多，后期四組小鼠24 h食量相近(見(jiàn)圖1、圖2)。

圖1 健康對(duì)照組與0分組、高分組、低分組EAE小鼠免疫后到21 d體重變化

圖2 健康對(duì)照組與0分組、高分組、低分組EAE小鼠免疫后到21 d 24 h食量變化

2.2 EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分 小鼠免疫后出現(xiàn)精神萎靡，懶動(dòng)，皮毛粗糙無(wú)光澤，偶有寒顫、體溫稍高癥狀，EAE高分組和低分組小鼠免疫后12 d開(kāi)始出現(xiàn)尾巴無(wú)力，遠(yuǎn)端下垂，后逐漸累及雙后肢和前肢，造成明顯運(yùn)動(dòng)障礙，小鼠神經(jīng)功能評(píng)分逐漸增加，到免疫18 d，低分組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分開(kāi)始降低，高分組小鼠評(píng)分持續(xù)增加，到免疫21 d沒(méi)有繼續(xù)增加；0分組和健康對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)明顯的肢體運(yùn)動(dòng)障礙，神經(jīng)功能評(píng)分均為0分(見(jiàn)圖3、圖4)。

圖3 健康對(duì)照組與0分組、高分組、低分組EAE小鼠免疫后到21 d神經(jīng)功能評(píng)分變化

4A：EAE小鼠尾巴遠(yuǎn)端下垂，無(wú)力，神經(jīng)功能評(píng)分1分；4B：EAE小鼠尾巴全癱，左后肢無(wú)力、行走拖拽，右后肢全癱，腳掌上翻，神經(jīng)功能評(píng)分7分；4C：EAE小鼠尾巴全癱，雙后肢全癱，左前肢無(wú)力，神經(jīng)功能評(píng)分9分

2.3 EAE腦組織髓鞘結(jié)構(gòu)變化 在透射電子顯微鏡下，健康對(duì)照組小鼠髓鞘橫截面呈黑色環(huán)形，形態(tài)結(jié)構(gòu)連續(xù)，無(wú)空泡、增粗和分層等損傷表現(xiàn)；EAE 0分組小鼠部分髓鞘結(jié)構(gòu)呈斷裂、分層、空泡變性；EAE高分組小鼠髓鞘損害嚴(yán)重，環(huán)形結(jié)構(gòu)不完整；EAE低分組小鼠髓鞘雖然完整，但有明顯增粗、分層樣改變(見(jiàn)圖5)。

5A：健康對(duì)照組(100 nm，10000×)，髓鞘橫截面為黑色連續(xù)環(huán)形結(jié)構(gòu)(↑)；5B：EAE0分組(100 nm，10000×)，部分髓鞘斷裂，呈分層、空泡變性(↑)；5C：EAE高分組(100nm，10000×)，大片髓鞘損害，環(huán)形結(jié)構(gòu)消失(↑)；5D：EAE低分組(100 nm，10000×)，髓鞘橫截面呈增粗、分層樣改變(↑)

2.4 EAE高分組不同腦區(qū)及脊髓VDR蛋白表達(dá)情況 比較EAE高分組與健康對(duì)照組的皮質(zhì)、白質(zhì)、小腦、腦干和脊髓的VDR蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)部位VDR蛋白的表達(dá)較健康對(duì)照組均呈不同程度的下降趨勢(shì)，其中腦干和脊髓的VDR蛋白表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046，P=0.009)，其余部位VDR蛋白表達(dá)下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1、圖6)。

表1 健康對(duì)照組和EAE高分組腦和脊髓組織的VDR蛋白表達(dá)情況比較

圖6 健康對(duì)照組和EAE高分組腦和脊髓組織的VDR蛋白表達(dá)比較

2.5 EAE各組脊髓組織中VDR蛋白的表達(dá)情況 分別檢測(cè)EAE 0分組、高分組、低分組的VDR蛋白表達(dá)，并與健康對(duì)照組相比較，發(fā)現(xiàn)VDR在EAE各組的脊髓組織中都表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，且都低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0分組P=0.005，高分組P=0.009)，其中以低分組較健康對(duì)照組下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。EAE各組VDR蛋白表達(dá)水平兩兩比較，發(fā)現(xiàn)高分組較0分組低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.716)，低分組較0分組VDR蛋白表達(dá)進(jìn)一步下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，同時(shí)低分組較高分組下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)(見(jiàn)表2、圖7)。

表2 健康對(duì)照組和EAE脊髓組織各疾病嚴(yán)重程度階段VDR蛋白的表達(dá)比較

圖7 健康對(duì)照組和0分組、高分組、低分組脊髓組織VDR蛋白的表達(dá)比較

3 討 論

MS最常見(jiàn)的臨床病程分型為：復(fù)發(fā)-緩解型(relapsing-remitting，RR)、原發(fā)進(jìn)展型(primary-progressive，PP)、繼發(fā)進(jìn)展型(secondary-progressive，SP)和進(jìn)展復(fù)發(fā)型(progressive-relapsing，PR)[14]。其中，約80%～85%的MS患者最初表現(xiàn)為復(fù)發(fā)-緩解病程，隨著每次的復(fù)發(fā)，患者可能會(huì)遺留不同程度的肢體功能障礙和(或)感覺(jué)障礙[2]。臨床上最常使用擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表(Expanded Disability Status Scale，EDSS)對(duì)MS患者功能系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以評(píng)估患者疾病嚴(yán)重程度和指導(dǎo)后續(xù)治療方案[15]。

根據(jù)MS女性多發(fā)的流行病學(xué)特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇雌鼠進(jìn)行EAE模型建立。而以MOG35-55為抗原誘導(dǎo)的EAE表現(xiàn)為復(fù)發(fā)-緩解病程，發(fā)病高峰期為14～20 d[16，17]。對(duì)EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分常用5分法或者10分法[18～20]，本次實(shí)驗(yàn)需要根據(jù)EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行分組，而Weaver’s 15分法對(duì)小鼠每個(gè)肢體運(yùn)動(dòng)情況都有細(xì)化的評(píng)分，并采用累計(jì)計(jì)分的方式，相較常用的評(píng)分方法更能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求；而且EAE小鼠發(fā)病通常由尾巴開(kāi)始，逐漸累及四肢，Weaver’s 15分法對(duì)四肢的細(xì)化評(píng)分能更好的體現(xiàn)小鼠疾病的進(jìn)展情況以及癥狀緩解情況，故本實(shí)驗(yàn)最終選擇了Weaver’s 15分法對(duì)EAE小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估。但是在造模的過(guò)程中出現(xiàn)了EAE小鼠疑似由于小腦和腦干脫髓鞘引起的軸向旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)[21]，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中不同的評(píng)分方案相結(jié)合也許更能客觀(guān)地量化EAE的神經(jīng)功能損傷情況。

實(shí)驗(yàn)以21 d為終點(diǎn)，根據(jù)Weaver’s 15分法和EAE小鼠由尾巴逐漸累及四肢的發(fā)病特點(diǎn)，當(dāng)評(píng)分=0時(shí)，EAE小鼠沒(méi)有表現(xiàn)明顯運(yùn)動(dòng)障礙，設(shè)為0分組；當(dāng)評(píng)分>0分且<6分時(shí)，小鼠肢體運(yùn)動(dòng)障礙多表現(xiàn)為輕癱或者步態(tài)不穩(wěn)，設(shè)為低分組；當(dāng)評(píng)分≥6分時(shí)，小鼠出現(xiàn)單側(cè)或者雙側(cè)肢體全癱或者累及雙側(cè)或單側(cè)前肢，設(shè)為高分組。通過(guò)對(duì)健康對(duì)照組和各組EAE小鼠體重、食量的記錄，觀(guān)察到EAE高分組和低分組小鼠在發(fā)病前會(huì)出現(xiàn)體重明顯下降，這與相關(guān)文獻(xiàn)描述一致[5，17]，0分組小鼠沒(méi)有觀(guān)察到典型的發(fā)病情況，體重也沒(méi)有明顯下降。在食量沒(méi)有明顯減少的情況下，高分組體重隨神經(jīng)功能評(píng)分增加呈持續(xù)降低，而低分組體重逐漸趨近0分組和健康對(duì)照組，神經(jīng)功能評(píng)分也逐漸降低。

通過(guò)在透射電子顯微鏡下觀(guān)察健康對(duì)照組和各組EAE小鼠髓鞘結(jié)構(gòu)的變化，健康對(duì)照組髓鞘橫截面呈黑色環(huán)形，結(jié)構(gòu)連續(xù)，無(wú)空泡、增粗和分層等損傷表現(xiàn)。EAE各組的髓鞘都有不同程度的損傷，以高分組髓鞘環(huán)形結(jié)構(gòu)消失為最嚴(yán)重，這與高的神經(jīng)功能評(píng)分相對(duì)應(yīng)；低分組髓鞘明顯增粗、分層，結(jié)合該組神經(jīng)功能評(píng)分在免疫后18 d降低的表現(xiàn)，推測(cè)該組更接近EAE的緩解狀態(tài)；值等注意的是0分組雖然神經(jīng)功能評(píng)分為0分，但是電鏡下髓鞘結(jié)構(gòu)不連續(xù)，且有空泡樣的破壞，說(shuō)明單單只靠神經(jīng)功能評(píng)分鑒別EAE的發(fā)病與否可能還欠完善。

根據(jù)電鏡結(jié)果提示EAE高分組髓鞘破壞最嚴(yán)重，所以實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)EAE高分組和健康對(duì)照小鼠的皮質(zhì)、白質(zhì)、小腦、腦干、脊髓的VDR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)部位的VDR蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，但是在腦干、脊髓下降趨勢(shì)顯著，這與EAE在腦干和脊髓病變最為顯著的結(jié)果相一致[12]。

接下來(lái)，考慮到EAE小鼠免疫后首發(fā)無(wú)力癥狀均表現(xiàn)在尾部，然后累及雙后肢，且VDR在脊髓下降趨勢(shì)更顯著，所以實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選擇脊髓為主要研究部位，對(duì)EAE 0分組、高分組、低分組脊髓組織VDR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并兩兩比較，發(fā)現(xiàn)VDR在EAE各組的脊髓組織中都低于健康對(duì)照組，EAE各組之間VDR蛋白表達(dá)水平兩兩比較后，發(fā)現(xiàn)0分組、高分組、低分組呈逐漸下降趨勢(shì)。VDR的表達(dá)水平與EAE病情程度的關(guān)系需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)說(shuō)明。

本次研究分別檢測(cè)了VDR在EAE小鼠腦和脊髓的表達(dá)情況，以及EAE各組神經(jīng)功能評(píng)分的小鼠脊髓組織的表達(dá)水平，有助于完善我們對(duì)EAE小鼠模型中VDR的認(rèn)識(shí)；同時(shí)為尋找1α，25-(OH)2D3的最佳治療時(shí)機(jī)和VDR表達(dá)之間的相關(guān)性提供理論依據(jù)，也為后期EAE進(jìn)行進(jìn)一步的1α，25-(OH)2D3干預(yù)實(shí)驗(yàn)和更多的臨床分析研究提供參考。