楊 晴，劉少華，楊長(zhǎng)青，耿銳梅，張 釗，劉東陽(yáng)，楊愛國(guó)*，李依婷*

煙草倍半萜合酶基因的克隆及功能鑒定

楊 晴1,2，劉少華1，楊長(zhǎng)青1，耿銳梅1，張 釗3，劉東陽(yáng)4，楊愛國(guó)1*，李依婷1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.云南省煙草公司曲靖市公司云南 曲靖 655000；4.四川省煙草公司涼山州公司，四川 涼山 615000）

萜類化合物在植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)以及抵御病原菌侵染過程中發(fā)揮重要作用，克隆煙草倍半萜合酶基因并研究其功能可為煙草萜烯合酶的功能鑒定及抗病育種提供理論依據(jù)。本研究從普通煙草紅花大金元中克隆獲得了一個(gè)倍半萜合酶基因，通過生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析、酶學(xué)性質(zhì)分析以及NtTPS21代謝產(chǎn)物的體外抑菌試驗(yàn)等方法，鑒定的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，開放閱讀框?yàn)?671 bp，編碼556個(gè)氨基酸，具有典型的萜類合酶催化活性位點(diǎn)，與擬南芥倍半萜合酶AtTPS21具有較高同源性。NtTPS21定位于核質(zhì)中，能夠被煙草青枯病菌感染誘導(dǎo)，且在青枯病抗病品種“巖煙97”中的表達(dá)水平顯著高于感病品種“長(zhǎng)脖黃”。NtTPS21能夠以法尼基焦磷酸（FPP）為底物，催化合成倍半萜類化合物β-石竹烯，其代謝產(chǎn)物對(duì)煙草青枯病菌的生長(zhǎng)具有顯著抑制效果，以上結(jié)果說(shuō)明基因及其代謝產(chǎn)物可能與煙草青枯病抗性相關(guān)。

煙草；；倍半萜合酶；β-石竹烯；青枯病抗性

青枯病是煙草種植過程中普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的一種根莖類病害。煙株一旦感染青枯病，煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)會(huì)受到嚴(yán)重影響，甚至造成整株死亡，給煙草產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的損失[1-3]。挖掘、鑒定和利用優(yōu)異的青枯病抗性基因，培育抗青枯病的煙草新品種是防治煙草青枯病最根本和有效的途徑之一。

萜類化合物（又稱類異戊二烯）是自然界中普遍存在的一類天然次生代謝產(chǎn)物，由單個(gè)或多個(gè)異戊二烯單元組成，其中倍半萜約有7000多種，是萜類化合物中結(jié)構(gòu)數(shù)量最多的一類[4-5]。植物體內(nèi)的倍半萜類化合物大多為揮發(fā)性物質(zhì)，在抵抗昆蟲侵害[6]，抑制病原菌活性[7-8]等方面發(fā)揮重要作用，是天然植物源農(nóng)藥的重要來(lái)源。大量研究發(fā)現(xiàn)，雙環(huán)倍半萜類化合物β-石竹烯具有較強(qiáng)的抑菌作用。例如牡荊揮發(fā)油（含43.12% β-石竹烯）對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、四聯(lián)球菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果[9]，β-石竹烯對(duì)蠟樣芽孢桿菌也具有一定的抗菌活性[10]。在擬南芥中，β-石竹烯由編碼的（E）-β-石竹烯合成酶催化形成，是擬南芥花柱頭釋放的主要揮發(fā)性物質(zhì)。突變可導(dǎo)致擬南芥花柱頭的細(xì)菌性丁香假單胞菌DC3000大量生長(zhǎng)，而組成型過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)DC3000的抗性顯著高于野生型，表明在植物抵御細(xì)菌性病原菌侵害過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。

煙草基因組中存在著大量萜烯合酶（Terpene synthase, TPS）編碼基因。然而，目前對(duì)煙草TPS基因的克隆及其在抵抗病原菌方面的研究報(bào)道十分有限。為了挖掘和鑒定煙草中參與青枯病抗性的TPS基因，我們首先利用β-石竹烯標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)煙草主要細(xì)菌性病原菌開展了平板抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-石竹烯對(duì)煙草青枯病菌具有特異性抑制作用。因此本研究根據(jù)擬南芥序列，對(duì)煙草中的β-石竹烯合成酶基因進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)，克隆獲得了煙草β-石竹烯合成酶基因，命名為。通過分析的表達(dá)特征，酶學(xué)性質(zhì)以及代謝產(chǎn)物的抑菌作用，鑒定的生物學(xué)功能，為后續(xù)深入研究萜類次生代謝物在植物抗逆脅迫中的分子調(diào)控機(jī)制及抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通栽培煙草（）品種“紅花大金元”，用于基因克?。弧伴L(zhǎng)脖黃”和“巖煙97”分別為煙草青枯病感病和抗病對(duì)照種質(zhì)，由國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)提供。Y45青枯菌種由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所遺傳育種中心提供。

1.2 方法

1.2.1 材料處理與取樣 （1）正常生長(zhǎng)的煙草材料。煙草品種“紅花大金元”種子經(jīng)消毒處理后播種在裝有滅菌土壤的花盆中，種植于人工氣候室。待煙株生長(zhǎng)至5葉期時(shí)，收集植株葉部組織，液氮速凍后放置于?80 ℃封存，用于基因克隆。（2）青枯病原菌脅迫處理的煙草材料。煙草品種“長(zhǎng)脖黃”和“巖煙97”種子經(jīng)消毒處理后播種在裝有滅菌土壤的花盆中，種植于人工氣候室，在幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，更換為霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至5葉期時(shí)，進(jìn)行青枯病菌接種處理：將活化的青枯病菌Y45稀釋至600=0.01，直接替換營(yíng)養(yǎng)液，發(fā)病條件為30 ℃，浸泡2 h后將青枯菌倒掉，更換為霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于接種0、2、3、7 d后收集根及莖部樣品，每個(gè)試驗(yàn)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，收集的樣品用液氮速凍后?80 ℃保存，用于基因表達(dá)特征分析。

1.2.2基因的克隆 將擬南芥AtTPS21的蛋白質(zhì)序列在煙草數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)，獲得煙草基因的參考序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物-F（5'-ATGGATTTGAGCAAAGGCTTGC CGG-3'）和-R（5'-TTATGGAACAGGATCA ACCAATATT-3'）。提取普通煙草紅花大金元葉片總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后作為基因克隆模板。使用引物-F和-R，以煙草葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 2.5 μL、2×Phanta Max Master Mix 25 μL、-F和-R引物各2.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至反應(yīng)體系為50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸100 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化回收后連接到pEASY-Blunt Zero克隆載體。陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確，獲得含有序列的克隆質(zhì)粒Blunt-。

1.2.3 NtTPS21的生物信息學(xué)分析 利用ORF finder（http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）軟件分析NtTPS21開放閱讀框及氨基酸序列；利用PSORT II Prediction（https //www.genscript.com/psort. html）預(yù)測(cè)NtTPS21蛋白的亞細(xì)胞定位；使用InterProSca（https//www.ebi.ac.uk/interpro/search/ sequence/）軟件對(duì)NtTPS21蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與其他物種的β-石竹烯合酶進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證其保守結(jié)構(gòu)域。利用MEGA7軟件將與擬南芥的34個(gè)萜烯合酶進(jìn)行比對(duì)，并通過鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Bootstrap=1000）。

1.2.4表達(dá)模式分析 根據(jù)基因的編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物-qF（5'-GCTAAGTTCTATTA CAAGGTGGTG-3）和-qR（5'-AAAGTACAC TCCCAATGCCC-3'）。分別提取“長(zhǎng)脖黃”和“巖煙97”在接種青枯病后不同時(shí)期根部和莖部的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以煙草基因?yàn)閮?nèi)參，利用2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，采用2-△△CT方法計(jì)算的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 NtTPS21的亞細(xì)胞定位 將編碼區(qū)CDS 序列（去掉終止密碼子）克隆到pBWA（V）HS-GLosgfp表達(dá)載體中，構(gòu)建基因融合綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)載體pBWA（V）HS--GLosgfp。將重組質(zhì)粒pBWA（V）HS--GLosgfp和對(duì)照空載質(zhì)粒pBWA（V）HS-Glosgfp分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101。以空載作為負(fù)對(duì)照，將含有目標(biāo)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌重懸液注射到本氏煙幼葉中進(jìn)行瞬時(shí)侵染，侵染后的煙草黑暗條件下培養(yǎng)12 h，再于正常光照下培養(yǎng)2 d，將侵染部位葉片置于 LEICA TCS SP8 激光共聚焦顯微鏡下觀察，確定熒光融合蛋白的定位。

1.2.6 NtTPS21的原核表達(dá)及體外反應(yīng)鑒定 NtTPS21的原核表達(dá)：將克隆到大腸桿菌高效表達(dá)載體pET28a中，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性菌株用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至600=0.5～0.6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)17 h后離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲裂解后離心收集上清，進(jìn)行蛋白凝膠電泳和染色，觀察蛋白誘導(dǎo)情況。

NtTPS21蛋白體外反應(yīng)：將裂解后的菌體上清加入含有法尼基焦磷酸（FPP）的反應(yīng)混合緩沖液中，于37 ℃恒溫箱反應(yīng)1 h后，用正己烷提取反應(yīng)產(chǎn)物。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，島津TQ8050）對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和成分分析。色譜柱為HP-INNOWAX 毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm× 0.25 μm），進(jìn)樣口溫度設(shè)置為250 ℃，柱室溫度50 ℃起步，以10 ℃/min的速度升溫至250 ℃，保溫5 min，氣化室和檢測(cè)室溫度均為250 ℃。

1.2.7 NtTPS21代謝產(chǎn)物的體外抑菌試驗(yàn) 將重組至pET28a并轉(zhuǎn)入能夠高效合成FPP的大腸桿菌工程菌株中。陽(yáng)性的NtTPS21工程菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)后，通過超聲裂解并用乙酸乙酯萃取濃縮獲得NtTPS21代謝產(chǎn)物。以無(wú)水乙醇為溶劑，將NtTPS21代謝產(chǎn)物稀釋至1 g/mL、100 mg/mL、50 mg/mL；將活化的青枯菌均勻地涂于培養(yǎng)基中，待菌液吹干后，均勻地?cái)[放4個(gè)6 mm無(wú)菌空白藥敏紙片，隨后在每個(gè)紙片上依次加入20 μL不同濃度的NtTPS21代謝產(chǎn)物以及對(duì)照無(wú)水乙醇，待樣品擴(kuò)散后，于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～18 h，觀察測(cè)量菌圈大小。

2 結(jié) 果

2.1 NtTPS21基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以普通煙草紅花大金元葉片cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得。該基因全長(zhǎng)1671 bp，編碼556個(gè)氨基酸（等電點(diǎn)：5.28；分子量：64.88 kD）。序列分析結(jié)果表明（圖1A），具有3個(gè)萜烯合成酶基因家族的保守結(jié)構(gòu)域，其中22-201位氨基酸為萜類合酶N末端結(jié)合域（N-terminal domain）；233-500位氨基酸為萜類合酶金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（metal-binding domain）；228-555位氨基酸為萜烯環(huán)化酶C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和高爾基體中定位的概率分別為60.9%、26.1%、8.7%和4.3%，因此，該蛋白可能是位于核質(zhì)中。

將擬南芥、番茄、水稻、棉花中已報(bào)道的石竹烯合酶與NtTPS21進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，NtTPS21與石竹烯合酶蛋白序列具有較高的相似性，且含有萜類合酶催化活性中心“DDXXD”、“RRX8W”和“NST/DTE”（圖1B）。

為分析NtTPS21與模式植物擬南芥萜烯合酶基因間親緣關(guān)系，通過MEGA7軟件對(duì)NtTPS21進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明，NtTPS21與擬南芥倍半萜合酶AtTPS21聚為同一簇（圖2），推測(cè)其具有類似的催化功能。

注：A，NtTPS21的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，其中a代表萜類合酶 N 末端結(jié)合域；b代表萜類合酶金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域；c代表萜烯環(huán)化酶C端結(jié)構(gòu)域。B，NtTPS21與其他物種石竹烯合酶的多序列比對(duì)，其中方框標(biāo)注的為萜烯合酶的保守結(jié)構(gòu)域“RRX8W”，“DDXXD”以及“NST/DTE”。AtTPS21：擬南芥石竹烯合酶；SlTPS12：番茄石竹烯合酶；OsTPS3：水稻石竹烯合酶；GhTPS：棉花石竹烯合酶。

2.2 NtTPS21的表達(dá)模式分析

“長(zhǎng)脖黃”和“巖煙97”分別是煙草青枯病抗病育種研究中典型的感病和抗病對(duì)照品種。為明確是否參與煙草抗青枯病原菌脅迫過程，分別對(duì)“長(zhǎng)脖黃”和“巖煙97”接種青枯病菌，通過qRT-PCR檢測(cè)在抗病和感病種質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在“長(zhǎng)脖黃”和“巖煙97”中，青枯病菌侵染均能強(qiáng)烈誘導(dǎo)的表達(dá)。但是在不同的接種時(shí)間點(diǎn)，在抗青枯病品種“巖煙97”中的表達(dá)量均顯著高于易感青枯病的“長(zhǎng)脖黃”。特別是在莖中，與“長(zhǎng)脖黃”相比，在“巖煙97”中表達(dá)水平提高了20～80倍（圖3）。以上結(jié)果表明可能參與了煙草青枯病的抗性防御過程。

圖2 NtTPS21與擬南芥萜烯合酶家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

注：A，接種青枯病菌不同時(shí)間后，根中NtTPS21的相對(duì)表達(dá)；B，接種青枯病菌不同時(shí)間后，莖中NtTPS21的相對(duì)表達(dá)。不同字母表示在p<0.05水平差異顯著，下同。

2.3 NtTPS21亞細(xì)胞定位

基因的亞細(xì)胞定位對(duì)研究該基因編碼的蛋白及行使功能的場(chǎng)所至關(guān)重要。將含有NtTPS21融合綠色熒光蛋白（GFP）的植物表達(dá)載體和僅表達(dá)GFP的對(duì)照載體分別在本氏煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)。通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，NtTPS21編碼的蛋白產(chǎn)物定位于核質(zhì)中（圖4），這一結(jié)果與NtTPS21蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖4 NtTPS21的亞細(xì)胞定位

2.4 NtTPS21的原核表達(dá)及酶學(xué)功能分析

為了分析NtTPS21的生化功能，將重組質(zhì)粒-pET28a轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明在相對(duì)分子質(zhì)量為65 kD附近位置出現(xiàn)了特異蛋白帶（圖5），該結(jié)果與NtTPS21蛋白的預(yù)測(cè)大小相一致。

以NtTPS21蛋白粗提物與底物FPP進(jìn)行體外反應(yīng)，用GC-MS檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NtTPS21的代謝主產(chǎn)物為β-石竹烯（圖6），與β-石竹烯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和分子碎片質(zhì)譜數(shù)據(jù)均一致（圖6，7），表明NtTPS21能夠以FPP為底物生成倍半萜類物質(zhì)β-石竹烯。

注：M，marker；1～2，0.5mmoL/L IPTG誘導(dǎo)的PET空載；3～4，0.5 mmoL/L IPTG誘導(dǎo)的NtTPS21-PET；5，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的NtTPS21-PET。紅色箭頭指示的為誘導(dǎo)出的NtTPS21的蛋白。

注：A，β-石竹烯標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS圖；B，NtTPS21蛋白與FPP底物體外反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS圖；C，PET空載蛋白與FPP底物體外反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS圖。

圖7 NtTPS21體外合成產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品β-石竹烯GC-MS分子碎片質(zhì)譜對(duì)比圖

2.5 NtTPS21代謝產(chǎn)物對(duì)煙草青枯病菌的抑制作用鑒定

為了分析是否與煙草的青枯病抗性相關(guān)，將NtTPS21蛋白在能夠高效合成FPP的大腸桿菌工程菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得NtTPS21的代謝產(chǎn)物。將純化的NtTPS21代謝產(chǎn)物添加到煙草青枯病菌培養(yǎng)基中，通過測(cè)量抑菌圈直徑，分析NtTPS21代謝產(chǎn)物對(duì)煙草青枯病菌的抑制作用。結(jié)果表明，與添加無(wú)水乙醇的空白對(duì)照相比，NtTPS21的代謝產(chǎn)物對(duì)煙草青枯病菌的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，并且其抑制強(qiáng)度隨濃度的升高而增強(qiáng)（圖8）。

注：β-石竹烯稀釋溶劑為無(wú)水乙醇，CK為無(wú)水乙醇。

3 討 論

植物倍半萜合酶催化底物FPP釋放焦磷酸基團(tuán)，形成結(jié)構(gòu)多樣的倍半萜類化合物。本研究從煙草中克隆了一個(gè)倍半萜合酶基因，序列分析表明其具有萜類合酶催化活性位點(diǎn)“DDXXD”，“RRX8W”以及“NST/DTE”?！癉DXX(D, E)”基序又稱為“α結(jié)構(gòu)域”，是Ⅰ型TPS酶的典型特征，可結(jié)合與異戊二烯基二磷酸相互作用的金屬輔因子（Mg2+或Mn2+）底物并促進(jìn)底物陽(yáng)離子的形成[13-15]。NtTPS21即為典型的Ⅰ型TPS酶，這與報(bào)道的植物中的TPS基因家族中所有單萜、倍半萜和半萜合酶只含有功能α域相一致[16]。對(duì)NtTPS21亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)均表明，NtTPS21定位于核質(zhì)中，與大部分倍半萜合酶的亞細(xì)胞定位相一致。進(jìn)化分析結(jié)果顯示NtTPS21與擬南芥倍半萜合酶AtTPS21聚為一類，推測(cè)其可能參與煙草中倍半萜類化合物的生物合成。體外酶學(xué)功能驗(yàn)證進(jìn)一步證實(shí)了NtTPS21是一個(gè)倍半萜合酶，并且能夠以FPP為底物合成β-石竹烯。

β-石竹烯是廣泛存在于植物中一類次生代謝產(chǎn)物，具有一定的抗菌活性，用NtTPS21代謝產(chǎn)物進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)煙草青枯病菌具有顯著抑制效果，且這種抑制作用與其濃度呈正相關(guān)。目前，編碼β-石竹烯的基因已經(jīng)在擬南芥、番茄、水稻、棉花、葡萄等物種中被分離鑒定，但是煙草中的石竹烯合成酶基因尚未被發(fā)現(xiàn)，是否參與煙草青枯病抗性防御過程也不清楚。本研究在煙草中分離鑒定了編碼β-石竹烯合成酶的基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR技術(shù)，分析在接種青枯病菌后不同時(shí)間的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠強(qiáng)烈響應(yīng)青枯病菌侵染。在青枯病抗感種質(zhì)中，在接種青枯病菌的抗性材料根、莖中的表達(dá)量均顯著高于在感病材料中的表達(dá)水平，說(shuō)明可能參與了煙草青枯病菌的抗性防御過程，但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，今后可通過創(chuàng)制組成型過量表達(dá)和定點(diǎn)突變基因的遺傳材料以及生理生化和分子生物學(xué)試驗(yàn)，開展在煙草青枯病抗性防御中的功能機(jī)制解析，為煙草青枯病抗病育種提供理論支撐和優(yōu)異分子靶標(biāo)。

4 結(jié) 論

本研究在煙草中克隆獲得一個(gè)定位于核質(zhì)中的倍半萜合酶基因，具有萜烯合酶典型的保守結(jié)構(gòu)域，與擬南芥具有較高同源性。NtTPS21能夠以FPP為底物合成倍半萜類化合物β-石竹烯。的表達(dá)水平受青枯病菌侵染強(qiáng)烈誘導(dǎo)，且在抗病品種“巖煙97”中的表達(dá)水平顯著高于感病品種“長(zhǎng)脖黃”。NtTPS21的代謝產(chǎn)物能夠顯著抑制青枯病菌的生長(zhǎng)。說(shuō)明可能參與了煙草對(duì)青枯病菌的抗性防御過程。

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Cloning and Functional Characterization of Sesquiterpene Synthase Genein Tobacco

YANG Qing1,2, LIU Shaohua1, YANG Changqing1, GENG Ruimei1, ZHANG Zhao3, LIU Dongyang4, YANG Aiguo1*, LI Yiting1*

(1. Institute of Tobacco Research of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Qujing Tobacco Company of Yunnan Province, Qujing, Yunnan 655000, China; 4. Liangshan Tobacco Company of Sichuan Province, Liangshan, Sichuan 615000, China)

Terpenoids play an important role in plant growth, development, stress response and resistance to pathogen infection. Cloning the sesquiterpene synthase genes of tobacco and studying their function can provide theoretical basis for functional identification and disease resistance breeding of tobacco. In this study, a sesquiterpene synthase genewas cloned from common tobacco variety Honghuadajinyuan, and its function was identified by bioinformatic analysis, expression pattern analysis, enzyme property analysis and bacteriostatic test in vitro of NtTPS21 fermentation products. The results showed that the open reading frame ofwas 1671 bp which encoded 556 amino acids. NtTPS21 had a typical terpene synthase catalytic active site and high homology withsesquiterpene synthase AtTPS21. NtTPS21 was localized in the cytoplasm and could be induced by Granville wilt of tobacco. The expression level ofin the resistant variety “Yanyan 97” was significantly higher than that in the susceptible variety “Changbohuang”. NtTPS21 can catalyze the synthesis of sesquiterpene β -caryophyllene, which has a significant inhibitory effect on the growth of granville wilt. These results indicate thatand its metabolites may be related to the resistence tom.

;; sesquiterpene synthase; β-caryophyllene;m resistance

S572.01

A

1007-5119（2022）03-0039-08

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.03.007

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC01）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1610232020001）；中國(guó)煙草總公司四川省公司重點(diǎn)科技項(xiàng)目（SCYC202003）

楊 晴（1998-），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锎紊x調(diào)控。E-mail：17806289623@163.com

，E-mail：楊愛國(guó)，yangaiguo@caas.cn；李依婷，liyiting@caas.cn

2021-11-21

2022-02-23