尹夢瑩 蔚亞楠 杜光輝 桂敏 黎志彬 鮑銳 龔亞菊 吳麗艷

摘要：【目的】克隆蒜芥茄WRKY1基因（SsWRKY1），并分析其在黃萎病病原菌脅迫下的表達(dá)模式，為探究WRKY1基因在野生蒜芥茄黃萎病抗性中的調(diào)控機(jī)制提供理論參考。【方法】利用染色體步移技術(shù)克隆SsWRKY1基因，通過在線生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;采用GFP融合蛋白表達(dá)法對WRKY1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測SsWRKY1基因在不同組織及接種黃萎病病原菌后不同時(shí)間的相對表達(dá)量。并分析9種野生茄材料接種黃萎病病原菌后的病情指數(shù)與WRKY1基因表達(dá)變化量的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】克隆獲得的SsWRKY1基因（GenBank登錄號MZ846202）ORF序列長度為1224 bp，編碼407個(gè)氨基酸殘基，蛋白相對分子量為44.87 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.91，屬于親水性不穩(wěn)定蛋白，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子特征。SsWRKY1蛋白含有2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（7.13%）、β-折疊（4.67%）、無規(guī)則卷曲（73.71%）和延伸鏈（14.50%）組成。SsWRKY1蛋白與番茄、野生潘那利番茄、野生番茄、馬鈴薯WRKY1蛋白的親緣關(guān)系較近。SsWRKY1基因在根和莖的相對表達(dá)量顯著高于葉中的相對表達(dá)量（P<0.05，下同）。黃萎病病原菌接種后不同時(shí)間，SsWRKY1基因的相對表達(dá)量均低于對照組（無菌水接種），但僅在24 h時(shí)二者差異達(dá)顯著水平。9種野生茄材料接種黃萎病病原菌后的病情指數(shù)與接種前后WRKY1基因表達(dá)變化量間呈顯著正相關(guān)。【結(jié)論】SsWRKY1屬于第Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，序列高度保守，在細(xì)胞核中表達(dá)，其基因具有組織表達(dá)特異性，黃萎病菌脅迫后該基因的表達(dá)下調(diào)，推測WRKY1在野生茄黃萎病抗性中起負(fù)調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 蒜芥茄;WRKY轉(zhuǎn)錄因子;黃萎病;基因克隆;亞細(xì)胞定位;表達(dá)分析

中圖分類號： S641.1;S436.411? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）04-1000-11

Cloning and expression analysis of SsWRKY1 gene in Solanum sisymbriifolium under stress of verticillium wilt disease

YIN Meng-ying1，2， YU Ya-nan1，2， DU Guang-hui2， GUI Min1， LI Zhi-bin1，

BAO Rui1， GONG Ya-ju1*， WU Li-yan1*

（1Horticultural Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan? 650205， China;

2Institute of Resource Plants， Yunnan University， Kunming， Yunnan? 650500， China）

Abstract：【Objective】The WRKY1 gene of Solanum sisymbriifolium （SsWRKY1） was cloned and its expression pattern under the stress of verticillium wilt disease was analyzed to provide a theoretical reference for exploring the regulatory mechanism of WRKY1 gene in the resistance to verticillium wilt. 【Method】SsWRKY1 gene was cloned by the genome walking technique， and its sequence was analyzed by bioinformatics software and a phylogenetic tree was constructed. The subcellular localization of WRKY1 protein was determined by its GFP fusion protein expression under its native promoter. The expression of SsWRKY1 in different tissues of S. sisymbriifolium at different times under verticillium wilt di-sease stress was analyzed by real-time quantitative PCR（qRT-PCR）. The correlation analysis between disease index and WRKY1 gene expression of 9 wild eggplant materials inoculated with the verticillium wilt pathogen was also analyzed. 【Result】The full-length open reading frame（ORF） sequence of SsWRKY1 gene （GenBank accession number：MZ846202） was 1224 bp， encoding 407 amino acids residues. Its protein molecular weight was 44.87 kD and its theoretical isoelectric point （pI） was 6.91， which indicated that SsWRKY1 was a hydrophilic and unstable protein. Its subcellular localization in the nucleus conformed to the characteristics of transcription factors. The SsWRKY1 protein contained two conserved WRKY domains and a C2H2-type zinc finger structure， indicating that SsWRKY1 was a class I WRKY transcription factor. Its secondary structure was mainly composed of α-helix （7.13%）， β-bridge （4.67%）， random coil （73.71%） and exten-ded strand （14.50%）. S. sisymbriifolium was closely related to S. lycopersicum， S. pennellii， S. arcanum and S. tuberosum. The relative expression of SsWRKY1 in roots and stems was significantly higher than that in leaves （P<0.05，the same below）. The relative expression of SsWRKY1 at different times after the inoculation of the verticillium wilt pathogen was lower than that of the control group （sterile water inoculation）， but the difference was significant at 24 h. There was a significant positive correlation between disease index and the variation in WRKY1 expression in 9 wild eggplant materials ino-culated with verticillium wilt pathogen. 【Conclusion】SsWRKY1 belongs to the class I of WRKY transcription factors， its sequence is highly conserved and is expressed in the nucleus. The gene expression of SsWRKY1 is tissue-specific and the expression of this gene decreased under verticillium wilt disease stress. SsWRKY1 gene may play a negative regulatory role in wild eggplant resistance to verticillium wilt.

Key words：Solanum sisymbriifolium;WRKY transcription factor;verticillium wilt;gene cloning;subcellular loca-lization;gene expression analysis

Foundation items：National Natural Science Foundation of China Regional Fund Project （31960594）;Yunnan Applied Basic Research Project （2019FB059）;Yunnan Joint Foundation for Agricultural Basic Research （2018FG001-022）

0 引言

【研究意義】黃萎?。╒erticillium wilt）是由輪枝菌（Verticillium spp.）引起的一種土傳性植物維管束病害，其病原菌微菌核在沒有寄主存在的條件下，可在土壤中存活十幾年之久，加之其形態(tài)和致病力易發(fā)生變異使得黃萎病防控日益復(fù)雜（Fradin and Thomma，2010;Inderbitzin et al.，2011），被稱作植物的“癌癥”。目前茄子黃萎病抗病材料主要為近緣野生種和半栽培種（莊勇和王述彬，2009）。我國云南省及周邊地區(qū)蘊(yùn)藏著豐富的黃萎病抗性野茄種質(zhì)資源（鄭殿升等，2013），其中，蒜芥茄（Solanum sisymbriifolium）具有較強(qiáng)的黃萎病抗性（Collonnier et al.，2001;郭堂勛等，2015;吳麗艷等，2017），但其抗性基因尚未被挖掘利用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用（Pandey and Somssich，2009），但在野茄抗黃萎病過程中的研究甚少。因此，克隆蒜芥茄WRKY基因并分析其表達(dá)特性，對深入探究該基因在蒜芥茄抗黃萎病過程中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Dang等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，煙草中過表達(dá)辣椒CaWRKY27基因能增強(qiáng)煙草對青枯病菌的抗性;Warren等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，將芍藥PlWRKY65基因沉默后，植株對細(xì)鏈孢霉感染更敏感;Long等（2021）研究認(rèn)為，甜橙CsWRKY22基因表達(dá)可降低其植株對潰瘍病的抗性;劉開等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，茄子SmWRKY65基因可能參與植株青枯病抗性調(diào)控;Freeboroug等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，木薯MeWRKY81基因參與對木薯花葉病毒的負(fù)調(diào)控因子。WRKY1作為較早被發(fā)現(xiàn)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子之一，在植物抗逆反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。如番茄LpWRKY1和辣椒CaWRKY1轉(zhuǎn)錄因子均被證明參與植物防御反應(yīng)（Hofmann et al.，2008;Oh et al.，2008），且番茄LpWRKY1轉(zhuǎn)錄因子在番茄抗晚疫病過程中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用（Cui et al.，2019）;草莓FaWRKY1轉(zhuǎn)錄因子是介導(dǎo)植株對尖孢炭疽病菌防御反應(yīng)的重要因子，能負(fù)調(diào)控果實(shí)對尖孢炭疽病的抗性（Sonia et al.，2009;Higuera et al.，2019）;蘋果輪紋病病原菌能誘導(dǎo)湖北海棠中MhWRKY1基因的表達(dá)，推測該基因參與防御輪紋病病原菌侵入的響應(yīng)（張計(jì)育等，2011）;棉花GbWRKY1轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，能負(fù)調(diào)控棉花對灰霉病菌和大麗輪枝菌抗性（Li et al.，2014）;煙草中過表達(dá)SpWRKY1基因能顯著提高植株對煙草疫霉的抗性（Li et al.，2015）;葡萄VvWRKY1基因可增強(qiáng)植株對霜霉病的抗性（Marchive et al.，2018）;水茄StWRKY-1基因在擬南芥中誘導(dǎo)表達(dá)后，擬南芥對茄子黃萎病表現(xiàn)出抗性（李笑等，2018）;擬南芥AtWRKY1基因能負(fù)調(diào)控丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000，Pst DC3000）的響應(yīng)（Fang et al.，2021）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)對蒜芥茄在黃萎病抗病過程中的主要差異基因、代謝通路等進(jìn)行深入分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種黃萎病病原菌后，WRKY1同源基因在蒜芥茄中顯著上調(diào)表達(dá)，推測該基因可能在蒜芥茄黃萎病抗病中發(fā)揮重要作用。【擬解決的關(guān)鍵問題】以蒜芥茄為材料，利用染色體步移技術(shù)（Genome Walking）克隆出蒜芥茄WRKY1基因（SsWRKY1）（GenBank登錄號MZ846202），對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在蒜芥茄不同組織（根、莖、葉）及接種黃萎病病原菌后不同時(shí)間的相對表達(dá)量，并對9種野生茄材料接種黃萎病病原菌24 h后WRKY1基因的表達(dá)情況與其病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，為探究WRKY1基因在野生蒜芥茄黃萎病抗性中的調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的9種野生茄材料（表1）種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所試驗(yàn)基地內(nèi)。黃萎病致病菌株大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）由本課題組保存提供。主要試劑：廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒（DL116-01）購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司;植物RNA提取試劑盒（R6827）購自O(shè)MEGA公司，GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒、2 ×TSINGKE Master qPCR Mix qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ）試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購自北京擎科生物科技有限公司;KOD FX高保真PCR酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司;2 ×Biorun Pfu PCR Mix酶購自武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司;T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pMD19-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。主要設(shè)備儀器：CFX96TM Realtime System熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）、T100TM PCR儀（美國Bio-Rad公司）、NanoDrop 超微量核酸蛋白分析儀（德國Implen公司）、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、頂置LED人工氣候箱（武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司）和徠卡正置熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1. 2 材料處理及取樣

于4片真葉期選取生長狀態(tài)良好的蒜芥茄植株，分別對其不同組織部位（根、莖、葉）進(jìn)行取樣，液氮速凍，儲存于-80 ℃超低溫冰箱，用于SsWRKY1基因在蒜芥茄不同組織中的表達(dá)分析。

參考吳麗艷等（2017）的方法，于4片真葉期利用浸根法對蒜芥茄進(jìn)行病原菌人工接種，以無菌水處理為對照，分別處理0、24 、48和72 h后，取其根部，待洗凈并擦干后液氮速凍，于-80 ℃超低溫冰箱，用于SsWRKY1基因在蒜芥茄接種黃萎病病原菌后不同時(shí)間的表達(dá)分析。

采用上述相同的方法進(jìn)行野生茄材料人工接種及取樣，用于WRKY1基因表達(dá)情況與其病情指數(shù)的相關(guān)分析。根據(jù)SsWRKY1基因在蒜芥茄接種黃萎病病原菌后不同時(shí)間的表達(dá)分析結(jié)果得到該基因表達(dá)量差異最大的時(shí)間點(diǎn)，取部分植株葉片，并參考吳麗艷等（2017）的方法統(tǒng)計(jì)剩余植株的抗病性和病情指數(shù)。以上每個(gè)材料均設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)10株植株。

1. 3 SsWRKY1基因克隆

1. 3. 1 基因組DNA提取 按照廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒說明提取蒜芥茄根部基因組DNA。

1. 3. 2 采用染色體步移技術(shù)擴(kuò)增SsWRKY1基因編碼區(qū)（CDS）序列 根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序得到的不完整CDS序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)3條特異引物SP1-R、SP2-R和SP3-R（表2）。以蒜芥茄基因組DNA為模板，以簡并引物L(fēng)AD1-F/LAD2-F/LAD3-F/LAD4-F與特異引物SP1-R配對進(jìn)行第1次巢式PCR，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性90 s;95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s，25 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min;進(jìn)行15個(gè)循環(huán)（94 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s，62 ℃ 30s，72 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s，44 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min）;72 ℃延伸5 min。以第1次巢式PCR產(chǎn)物為模板，以特異引物SP2與簡并引物AC-F配對，進(jìn)行第2次巢式PCR;以第2次巢式PCR產(chǎn)物為模板，以特異引物SP3與簡并引物AC-F配對，進(jìn)行第3次巢式PCR，第2、3次PCR擴(kuò)增程序相同，均為：95 ℃預(yù)變性90 s;94 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃預(yù)變性5 min。反應(yīng)體系25.0 μL：模板1.0 μL，2×KOD1 PCR Mix 0.5 μL，dNTP Mix 5.0 μL，10 × Buffer 12.5 μL，10.0 μmol/L 上、下游引物各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)充至25.0 μL。

利用1%瓊脂糖凝膠電泳分別對第2、3輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，待目的片段檢測確認(rèn)后，對其進(jìn)行回收、純化并連接至pMD19-T載體上，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定后，選取符合要求的陽性質(zhì)粒送至昆明擎科生物科技有限公司測序。

1. 4 生物信息學(xué)分析

使用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORFfinder查找SsWRKY1基因的開放閱讀框（ORF），利用ProtParam對SsWRKY1蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測;利用Cell-PLoc 2.0對蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，利用ProtScale對蛋白的親/疏水性進(jìn)行預(yù)測;利用SOPMA對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，同時(shí)利用SWISS-MODEL對蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST搜索與SsWRKY1蛋白同源序列，利用DNAMAN 9.0進(jìn)行同源比對，最后利用MEGA X的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（1000次重復(fù)，其他為默認(rèn)設(shè)置）。

1. 5 亞細(xì)胞定位試驗(yàn)

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)攜帶Aar Ⅰ酶切位點(diǎn)的特異性引物SsWRKY1-F-AarⅠ/SsWRKY1-R-AarⅠ（表2），以蒜芥茄DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50.0 μL：Biorun Pfu PCR Mix 25.0 μL，10 μmol/L正、反向引物（SsWRKY1-F-AarⅠ和SsWRKY1-R-AarⅠ）各2.0 μL，cDNA模板1.0 μL，Nuclease-free H2O 20.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 73 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。然后用AarⅠ內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用BsaⅠ和Eco31Ⅰ對pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)純化回收后用T4連接酶連接，從而構(gòu)建pBWA（V）HS-SsWRKY1-GLosgfp融合表達(dá)載體。

采用液氮法將空載體pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp（陰性對照）和重組載體WA（V）HS-SsWRKY1-GLosgfp轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。隨后在YEP固體培養(yǎng)基（含100 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平）上進(jìn)行陽性克隆篩選。挑取單克隆至YEP液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)（28 ℃，220 r/min），經(jīng)菌液PCR檢測為陽性后繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm=0.6時(shí)收集菌體。

利用含有100 μmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸和10 mmol/L氯化鎂的懸浮液對收集菌體進(jìn)行重懸，并調(diào)至重懸菌液OD600 nm=0.2后室溫孵育4 h。通過瞬時(shí)表達(dá)法將重懸菌液注射至本氏煙草葉片，隨后置于恒溫培養(yǎng)箱（光照16 h/黑暗8 h）中培養(yǎng)48 h。然后用1 μg/mL DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）染色劑對注射菌液的葉片進(jìn)行染色處理。最后，利用正置熒光顯微鏡觀察煙草細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）熒光信號的分布情況。

1. 6 蒜芥茄及其他野茄材料中WRKY1基因表達(dá)分析

RNA提取參照植物RNA提取試劑盒說明進(jìn)行操作?？俁NA按照GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)目的基因的cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物SsWRKY1-F/ SsWRKY1-R（表2），以CYP為內(nèi)參基因，利用2×TSINGKE Master qPCR Mix qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ）試劑盒對WRKY1基因進(jìn)行表達(dá)分析。每處理重復(fù)3次，以無菌水接種處理為對照。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。WRKY1基因的相對表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，通過SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，并使用GraphPad Prism 8制圖。參照吳麗艷等（2017）的病情調(diào)查方法及種質(zhì)群體抗性分級標(biāo)準(zhǔn)對9種野茄材料進(jìn)行黃萎病抗性鑒定，利用雙變量-Spearman法對基因表達(dá)變化量和病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SsWRKY1基因克隆及序列分析結(jié)果

經(jīng)3輪PCR擴(kuò)增后獲得約1500 bp條帶（圖1）。將其測序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，利用ORFfinder查找ORF，結(jié)果顯示該序列包含SsWRKY1基因（GenBank登錄號MZ846202）完整的ORF，長度為1224 bp，編碼407個(gè)氨基酸殘基（圖2）。

2. 2 SsWRKY1蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析及多重序列比對結(jié)果

從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索出10種已知植物的WRKY1蛋白序列，并利用MEGA X對SsWRKY1蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果（圖3）顯示，SsWRKY1蛋白和番茄（S. lycopersicum）、野生潘那利番茄（S. pennellii）、野生番茄（S. arcanum）及馬鈴薯（S. tuberosum）WRKY1蛋白的親緣關(guān)系較近。

氨基酸序列多重比對結(jié)果（圖4）顯示，SsWRKY1與其他10種植物氨基酸序列的相似性為75.82%，且與其他植物一樣，蒜芥茄SsWRKY1也具有WRKY功能結(jié)構(gòu)域，序列一致性達(dá)100.00%，表明SsWRKY1蛋白的氨基酸序列高度保守，蛋白結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，暗示其生物學(xué)功能與其他植物WRKY1轉(zhuǎn)錄因子相似。SsWRKY1蛋白含有2個(gè)WRKY保守基序，分別存在于CDS的中部和后部，且具有典型的CX4-5CX22-23HX1H鋅指結(jié)構(gòu)（C2H2型），符合Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子的特征。

2. 2. 2 SsWRKY1蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

SsWRKY1蛋白的理論分子量為44.87 kD，分子式為C1908H3051N577O649S13，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為56個(gè)，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為57個(gè)，理論等電點(diǎn)（pI）為6.91，推測其為酸性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)為64.67，為不穩(wěn)定蛋白;親水性系數(shù)為-1.125，表明SsWRKY1蛋白為親水性蛋白;Cell-PLoc 2.0預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核上（圖5）。SsWRKY1蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，分別占7.13%、4.67%、73.71%和14.50%（圖6）。蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖7所示。

2. 3 SsWRKY1蛋白亞細(xì)胞定位驗(yàn)證結(jié)果

由圖8可知，在含pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp空載體的煙草細(xì)胞中，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜綠色熒光均分布有綠色熒光，但在含pBWA（V）HS-SsWRKY1-GLosgfp融合表達(dá)載體的煙草細(xì)胞中，僅細(xì)胞核均分布有綠色熒光，說明SsWRKY1蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核上，與Cell-PLoc 2.0預(yù)測結(jié)果一致，符合轉(zhuǎn)錄因子特征，證明SsWRKY1蛋白在細(xì)胞核中發(fā)揮作用和功能。

2. 4 SsWRKY1基因組織表達(dá)特性分析結(jié)果

由圖9可知，SsWRKY1基因在蒜芥茄根、莖、葉中均有表達(dá)，但相對表達(dá)量存在明顯差異，其中在根中的相對表達(dá)量最高，其次為莖，均顯著高于葉片中的相對表達(dá)量（P<0.05，下同）。

2. 5 接種黃萎病病原菌后SsWRKY1基因表達(dá)分析結(jié)果

利用qRT-PCR檢測SsWRKY1基因在蒜芥茄接種黃萎病病原菌后72 h內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果（圖10）顯示，對照組中SsWRKY1基因的相對表達(dá)量呈先升高后降低再升高的變化趨勢，其相對表達(dá)量在24 h達(dá)最高，48 h降至最低，但在黃萎病病原菌處理組中，SsWRKY1基因的相對表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，48 h為SsWRKY1基因相對表達(dá)量的最低。同一時(shí)間點(diǎn)上，處理組中SsWRKY1基因的相對表達(dá)量均低于對照組，其中在24 h時(shí)二者差異最大，達(dá)顯著水平。因此，24 h時(shí)可作為后續(xù)野生茄材料WRKY1基因的相對表達(dá)量與其病情指數(shù)的相關(guān)分析取樣時(shí)間點(diǎn)。

2. 6 野生茄材料WRKY1基因的相對表達(dá)量與病情指數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果

對9種野茄材料進(jìn)行黃萎病抗性鑒定，結(jié)果（表3）顯示，蒜芥茄（種質(zhì)編號197）病情指數(shù)為8，屬于高抗材料;180、194、192-1和192-2的病情指數(shù)為35～55，屬于中抗材料;121-3-1、121-3-2和245-2-2的病情指數(shù)為55～75，屬于感病材料;而239-3-2的病情指數(shù)為88，屬于高感材料。利用qRT-PCR檢測9種野生茄材料接種黃萎病病原菌24 h后葉片中WRKY1基因的相對表達(dá)量，并計(jì)算其與對照組之間的差值（基因表達(dá)變化量），結(jié)果（表3）顯示，所有植株在接種黃萎病病原菌24 h后體內(nèi)WRKY1基因的相對表達(dá)量較對照組發(fā)生變化。利用SPSS 22.0對表達(dá)變化量與病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果（表3）顯示9種野生茄材料的病情指數(shù)與接種前后WRKY1基因表達(dá)變化量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（R）為0.6890。

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色（Rushton et al.，2010），近年來相關(guān)研究主要集中在模式植物的基因克隆、蛋白的功能研究，對茄子中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究較少。由于本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序獲得的WRKY1基因CDS序列不完整，為了獲得完整的基因序列，本研究利用染色體步移技術(shù)從蒜芥茄克隆獲得SsWRKY1基因完整ORF序列，將其編碼的氨基酸序列與番茄、煙草等其他10種植物的WRKY1蛋白氨基酸序列高度相似，相似性達(dá)75.82%，其中WRKY功能結(jié)構(gòu)域的一致性為100.00%，表明本研究克隆結(jié)果準(zhǔn)確，方法可行，為克隆WRKY基因不完整序列提供技術(shù)參考。雖然現(xiàn)已證實(shí)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用，但有關(guān)WRKY基因及其編碼蛋白的功能在茄子黃萎病抗性中的研究報(bào)道較少。本研究以黃萎病高抗材料蒜芥茄為研究對象，克隆得到黃萎病抗性候選基因SsWRKY1，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)特征分析，不僅能為后續(xù)研究SsWRKY1基因的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)，也為其他植物黃萎病抗性相關(guān)WRKY基因的挖掘鑒定及利用提供參考依據(jù)。

根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的特征，可將WRKY家族分為3類：Ⅰ類WRKY家族成員含有2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2型;Ⅱ和Ⅲ類成員均只含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，但Ⅱ類成員的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，Ⅲ類成員的卻是C2HC型（Eulgem et al.，2000）。本研究通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，SsWRKY1蛋白的第433～597位和第964～1137位氨基酸各含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，由此推測SsWRKY1屬于Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類WRKY起源最早（Ulker et al.，2004），而Ⅱ類是Ⅰ類WRKY丟失1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域形成的（Xie et al.，2005）。由此推測，SsWRKY1基因在蒜芥茄WRKY基因家族成員中起源較早，其與蒜芥茄Ⅱ和Ⅲ類WRKY基因家族成員的關(guān)系尚待研究。

較多研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核內(nèi)，如番茄SlWRKY6（周濤等，2020）、煙草NtWRKY53（劉萬峰等，2021）和馬鈴薯StWRKY8（薛珍等，2015）。本研究首先通過Cell-PLoc 2.0對SsWRKY1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示其可能位于細(xì)胞核中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對SsWRKY1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其確實(shí)位于細(xì)胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子特征，表明其可能參與細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，與上述前人研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，煙草NtWRKY基因（向小華等，2016）、茄子SmWRKY65基因（劉開等，2021）和甘薯IbWRKY75基因（劉世芳等，2020）在根、莖和葉中均有表達(dá)，但不同基因在不同組織中的表達(dá)水平不同。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，SsWRKY1基因在蒜芥茄根中的相對表達(dá)量最高，在葉片中的相對表達(dá)量較低，與水茄StWRKY1的表達(dá)結(jié)果（李笑，2018）一致。目前，已有研究證實(shí)，WRKY基因的表達(dá)受到各種生物和非生物脅迫因子的誘導(dǎo)（李笑等，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組中SsWRKY1基因的相對表達(dá)量呈先升高后降低再升高的變化趨勢，2個(gè)拐點(diǎn)分別出現(xiàn)在24和48 h，而黃萎病病原菌處理組中，SsWRKY1基因的相對表達(dá)量呈先降低再升高的變化趨勢，48 h為SsWRKY1基因相對表達(dá)量的最低點(diǎn)。因此，接種后的24和48 h是研究抗黃萎病基因的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，該結(jié)論在前人研究（Gayoso et al.，2010;Tan et al.，2015;李笑，2018）中也得到證實(shí)。本研究中，由于24 h時(shí)SsWRKY1基因相對表達(dá)量在處理組與對照組間差異最大，且達(dá)到顯著水平，故選擇黃萎病病原菌接種處理24 h作為后續(xù)研究SsWRKY1基因在蒜芥茄黃萎病抗病過程中的重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。此外，本研究對9種野生茄材料接種黃萎病病原菌后的病情指數(shù)與WRKY1基因表達(dá)變化量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示二者之間呈顯著正相關(guān)，由于病情指數(shù)與抗病性呈負(fù)相關(guān)，因此推測WRKY1基因可能在蒜芥茄抗黃萎病過程中起負(fù)調(diào)控作用。該研究結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了WRKY1基因與植物黃萎病抗性緊密相關(guān)。雖然本研究中僅有9種野生茄材料參與相關(guān)分析，但其涵蓋了不同黃萎病抗性水平的材料，可在一定程度上反映出WRKY1基因的表達(dá)水平與黃萎病抗性之間的關(guān)系，為后續(xù)篩選抗性基因提供研究思路。

4 結(jié)論

SsWRKY1屬于第Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，序列高度保守，在細(xì)胞核中表達(dá)，其基因具有組織表達(dá)特異性，黃萎病菌脅迫后該基因的表達(dá)下調(diào)，推測WRKY1在野生茄黃萎病抗性中起負(fù)調(diào)控作用。

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收稿日期：2021-09-17

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（31960594）;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（2019FB059）;云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)面上項(xiàng)目（2018FG001-022）

通訊作者：龔亞菊（1965-），https：//orcid.org/0000-0002-7961-6523，研究員，主要從事蔬菜育種與栽培研究工作，E-mail：gongyaju@sina.com;吳麗艷（1981-），https：//orcid.org/0000-0003-2974-6765，副研究員，主要從事蔬菜育種與栽培研究工作，E-mail：wly@yaas.org.cn

第一作者：尹夢瑩（1996-），https：//orcid.org/0000-0002-5851-6275，主要從事蔬菜分子輔助育種研究工作，E-mail：YinDream19@163.com