臧偉偉，齊文革，楊 賀，張玉敏

輸血可能傳播乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，感染人體可出現(xiàn)慢性肝炎、肝硬化和肝癌等疾病，對血液使用安全提出了更高的要求[1]。以往，我國主要采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測無償獻(xiàn)血人群HBV感染情況。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟和發(fā)展，核酸檢測(nucleic acid testing，NAT)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于HBV篩查，并發(fā)現(xiàn)血液樣本存在ELISA檢測HBsAg陰性而NAT檢測陽性情況[2]。臨床上將這種HBsAg陰性但HBV DNA陽性的感染稱為隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)，屬于HBV感染的特殊類型，也可經(jīng)輸血或血制品等途徑傳播。OBI可在機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)或免疫功能低下時(shí)促使HBV活化，造成肝損傷。在無償獻(xiàn)血人群中，可能存在一定的OBI流行[3]。由于全球各地檢測血清HBV DNA方法、病毒流行性和人口學(xué)特征存在差異，目前仍無法明確OBI的流行病學(xué)特征[4]。為確保用血安全，降低HBV輸血感染風(fēng)險(xiǎn)，本研究對無償獻(xiàn)血人群中的OBI者展開調(diào)查，并進(jìn)行血清學(xué)和分子生物學(xué)特征分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 血清樣本來源 2021年1月～2021年12月于我站采集的無償獻(xiàn)血者血液樣本107397份，男性57146例，女性50251例；年齡為19～55歲，平均年齡為(35.2±5.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)獻(xiàn)血者符合國家衛(wèi)生部、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布的《獻(xiàn)血者健康檢查要求(GB 18467-2011)》的規(guī)定[5]；(2)獻(xiàn)血前均經(jīng)血清HBsAg和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶初篩合格；(3)符合《赫爾辛基宣言》及其附錄準(zhǔn)則中的倫理學(xué)要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)獻(xiàn)血者近期有服藥史；(2)標(biāo)本存在溶血或脂血；(3)未能在4 h內(nèi)完成NAT檢測。

1.2 血清HBsAg檢測 采用ELISA法檢測2次血清HBsAg(廈門英科新創(chuàng)科技有限公司和上?？迫A生物工程股份有限公司)；采用PCR法對兩次ELISA檢測血清HBsAg均陰性樣本進(jìn)行HBV DNA檢測(上?？迫A生物工程股份有限公司)；使用瑞士羅氏公司的Cobas e601全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測血清HBV DNA陽性樣本HBsAg、HBeAg、抗-HBc、抗HBe和抗-HBs；使用中國賽默飛世爾科技有限公司的Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀測定OBI樣本HBV DNA載量；采用熒光PCR法檢測OBI樣本HBV基因分型(廈門泰普生物科學(xué)有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 血清HBsAg檢測情況 在107397例無償獻(xiàn)血人群血清中，兩次ELISA法檢測HBsAg均為陰性樣本106953例，至少1次HBsAg陽性樣本444例；在兩次ELISA法檢測HBsAg均為陰性的樣本中，經(jīng)NAT檢測HBV DNA陽性34例，經(jīng)再次血清標(biāo)志物檢測后HBsAg陽性3例，判為無癥狀慢性感染，血清學(xué)標(biāo)志物檢測均陰性2例，判為窗口期感染，血清抗-HBs、抗-HBe或抗-HBc陽性29例，確認(rèn)為OBI。OBI感染率為0.27‰(29/106953/1:3688)。

2.2 OBI樣本血清學(xué)模式分布情況 見表1。

表1 29例OBI患者血清學(xué)模式(%)分布情況

2.3 不同年齡、性別和獻(xiàn)血次數(shù)人群OBI感染率比較 自19～55歲的各年齡段獻(xiàn)血人群均存在OBI感染情況，OBI感染率自0.09‰～0.41‰不等；19～29歲年齡段獻(xiàn)血人群OBI感染率最低，50～55歲年齡段獻(xiàn)血人群OBI感染率最高，且該年齡段重復(fù)獻(xiàn)血者OBI感染率占比較高(表2)。

表2 不同年齡、性別和獻(xiàn)血次數(shù)人群OBI感染率[n(‰)]比較

2.4 不同血清學(xué)模式OBI獻(xiàn)血者血清病毒載量和基因分型比較 血清抗-HBs/抗-HBc陽性和抗-HBs/抗-HBe/抗-HBc陽性O(shè)BI獻(xiàn)血者病毒載量>1000 IU/mL的比率顯著多于僅血清抗-HBc陽性者(P<0.05，表3)；不同血清學(xué)模式OBI獻(xiàn)血者HBV基因分型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表3 不同血清學(xué)模式OBI獻(xiàn)血者血清病毒載量[n(%)]比較

表4 不同血清學(xué)模式OBI獻(xiàn)血者HBV基因分型[n(%)]比較

3 討論

OBI指人體血清HBsAg陰性，但血清或肝組織可檢測到HBV DNA陽性的一種HBV感染。在處于免疫抑制狀態(tài)的人群、HBV感染恢復(fù)人群、獻(xiàn)血者、慢性肝病患者均可存在OBI[6]。OBI能夠增加輸血、器官移植、血液透析等患者感染HBV的風(fēng)險(xiǎn)，誘導(dǎo)免疫抑制群體HBV二次激活，引發(fā)急性或慢性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌等疾病[7]。本研究采用ELISA法檢測聯(lián)合NAT技術(shù)對無償獻(xiàn)血人群血液樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示血清HBsAg陰性仍可能系窗口期感染可能。在血清抗-HBc陽性的29例人群被確認(rèn)為OBI，其感染率為0.027%(1∶3688)，遠(yuǎn)低于西非國家感染率(1：67)[8]，也低于國內(nèi)韶關(guān)地區(qū)(1∶1126)[9]或常州地區(qū)(1∶1216)[10]的感染率。目前，OBI在不同地區(qū)的感染率存在較大差異的原因可能與各地區(qū)的人口學(xué)特征及HBsAg檢測手段的靈敏度不一致有關(guān)[11]。

研究表明，OBI可伴有抗-HBc、抗-HBs、抗-HBe陽性，其中抗HBc與HBV的自然感染有關(guān)，半衰期長，可在血清中保持長期穩(wěn)定狀態(tài)，出現(xiàn)于人群HBV感染的全過程，被認(rèn)為是OBI血清學(xué)的一種重要特征，常作為OBI的常規(guī)檢測標(biāo)志物[12,13]。本研究顯示，抗-HBc陽性例數(shù)最多，占比為35.3%；其次為抗-HBc陽性/抗-HBe陽性或抗-HBc陽性/抗-HBs陽性，占比分別為23.5%和17.7%；抗-HBc陽性/抗-HBs陽性/抗-HBe例數(shù)最少，占比為8.8%，與深圳地區(qū)[14]調(diào)查結(jié)果較為一致，說明抗-HBc陽性在診斷OBI方面具有重要的提示作用，需重視對此指標(biāo)的檢測和分析，可在窗口期感染篩查或?qū)o償獻(xiàn)血人群進(jìn)行追蹤調(diào)查時(shí)使用該指標(biāo)，以了解HBV感染的血清學(xué)狀態(tài)。研究表明，獻(xiàn)血人群血清抗-HBc單獨(dú)陽性者居多，其存在與HBV的再激活密切相關(guān)[15]。抗-HBc陽性/抗-HBe陽性/抗-HBs陽性血清學(xué)模式在OBI人群中的占比最低，說明OBI人群存在三種抗HBV抗體同時(shí)存在的情況，其血液作為血制品仍具有傳播HBV的風(fēng)險(xiǎn)。血清抗-HBs是一種保護(hù)性抗體，可與人體內(nèi)其他免疫機(jī)能共同發(fā)揮作用清除HBV感染。抗-HBe則是判斷HBV復(fù)制活躍性的指標(biāo)，兩者同時(shí)存在提示OBI感染者可能存在HBV免疫逃亡情況[16]。本研究中，19～29歲年齡段的獻(xiàn)血人群OBI感染率最低，50～55歲年齡段的獻(xiàn)血人群OBI感染率最高且該年齡段重復(fù)獻(xiàn)血者OBI感染率占比較高，提示獻(xiàn)血人群長期反復(fù)暴露在HBV易感環(huán)境中是引起OBI的主要因素。低年齡段群體OBI感染率低的原因也可能與該群體接受了乙肝疫苗的計(jì)劃免疫接種有關(guān)，疫苗的接種降低了該年齡段獻(xiàn)血者HBV感染風(fēng)險(xiǎn)[17]。

研究發(fā)現(xiàn)，人體血清HBV DNA載量呈低水平狀態(tài)是OBI獻(xiàn)血人群最為顯著的特征。由于血液檢測靈敏度不穩(wěn)定或HBV基因組S區(qū)出現(xiàn)變異可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，OBI可能存在漏診風(fēng)險(xiǎn)，通過對其他血清學(xué)標(biāo)志物及病毒載量的研究，可進(jìn)一步了解HBV感染模式，提高OBI的診斷率[18]?；诖?，本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)一步對OBI人群血清病毒水平進(jìn)行了定量分析，結(jié)果顯示可定量的OBI獻(xiàn)血者病毒載量一般不超過100 IU/mL，證實(shí)OBI獻(xiàn)血人群存在低水平HBV DNA的結(jié)論?？?HBc陽性/抗-HBs陽性或抗-HBc陽性/抗-HBs陽性/抗-HBe陽性血清學(xué)模式的OBI獻(xiàn)血者病毒載量大于1000 IU/mL的比率顯著高于抗-HBc陽性者，此情況可能為HBV基因的S區(qū)逃逸突變或啟動(dòng)子突變所致[19]。此外，有8例樣本未檢測出病毒載量，可能因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測受限而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，也可能是獻(xiàn)血者本身真陰性而NAT檢測結(jié)果為假陽性造成的[20]。本研究尚未對上述樣本采取進(jìn)一步HBV DNA檢測及追蹤樣本的感染情況，會在后續(xù)研究中開展這些調(diào)查分析。本研究還顯示，OBI獻(xiàn)血者HBV C型基因感染占比為62.1%，B型基因感染占比為27.6%，未能分型占比為10.3%，與我國HBV基因型分布特征一致。一般認(rèn)為，我國南方地區(qū)以B型感染為主，北方地區(qū)以C型感染為主[21]。

綜上所述，血清HBsAg陰性樣本可能存在OBI，低年齡段獻(xiàn)血人群OBI感染率較低，OBI獻(xiàn)血人群的血清學(xué)表現(xiàn)模式以抗-HBc陽性為主，病毒載量呈低水平狀態(tài)，HBV基因型中以C型感染占比多。結(jié)合上述特征，針對當(dāng)前備受關(guān)注的HBV殘存感染風(fēng)險(xiǎn)問題，若引入血清抗-HBc檢測，有可能大幅降低輸血感染HBV風(fēng)險(xiǎn)，保證了用血的進(jìn)一步安全。