何竹青，王利，王瀅迪，郇鵬飛，楊玉芳，何建成

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是第二大神經(jīng)退行性疾病，屬于中醫(yī)“顫證”的范疇[1-2]。 根據(jù)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，陰虛動風(fēng)證是臨床最常見的證型[3-4]。 PD 根本病機(jī)為臟腑失調(diào)，以肝腎陰虛為主，“瘀”“痰”“毒”互結(jié)為要，為虛實夾雜之疾。復(fù)方地黃顆粒便是基于以上理論研制并經(jīng)臨床反復(fù)驗證，是治療陰虛動風(fēng)證帕金森病取得良好效果的中藥復(fù)方。 動物實驗發(fā)現(xiàn)本方通過多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，其機(jī)制具體體現(xiàn)在抗氧化應(yīng)激[5]，抗細(xì)胞凋亡[6]，提高自噬水平[7]等方面。 本研究將從對血清環(huán)核苷酸的調(diào)節(jié)及損傷的多巴胺能神經(jīng)元修復(fù)作用兩方面，進(jìn)一步探討CDG 發(fā)揮作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

24 只 SPF 級 C57BL/6 雄性健康小鼠，7 ～ 8 周齡，體重20 ～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司【SCXK(滬)2017-0005】，實驗動物飼養(yǎng)及觀察于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行【SYXK(滬)2020-0009】。 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，自由進(jìn)食、飲水。 飼養(yǎng)環(huán)境:室溫(23 ± 2)℃，相對濕度(55 ±10)%，光照、黑夜12 h 循環(huán)。 本實驗動物飼養(yǎng)及操作皆符合上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的相關(guān)審批(PZSHUTCM200717037)。

1.1.2 主要試劑與儀器

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(Sigma，M0896-100MG)；cAMP、cGMP 試劑盒(上海威奧生物科技有限公司，EM3362S/EM3363S)；TH(Sigma，sc-25269 AC)；Beta Actin(Proteintech，20536-1-AP)。

病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016)；體視顯微鏡(中國麥克奧迪公司，型號MoticSMZ-171)； 多 功 能 酶 標(biāo) 儀 (美 國 BioTek，Synergy 2)；近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司，OdysscyCLx)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法

24 只C57BL/6 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表將24 只小鼠，隨機(jī)分成正常組(Normal)、模型組(MPTP+NS)、治療組(MPTP+CDG)。 16 只小鼠采用MPTP 腹腔注射法制備陰虛動風(fēng)證PD 模型，MPTP 溶于無菌生理鹽水中，按30 mg/kg 劑量腹腔注射，每日1 次，連續(xù)5 d；設(shè)正常組8 只，腹腔注射相同體積的生理鹽水。

2.2 兩組患者血漿E2、CRP、Lp-a及FIB水平比較 冠心病組較對照組E2水平明顯降低(P<0.05)，而CRP、Lp-a及FIB水平均升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

造模成功標(biāo)準(zhǔn):在帕金森病造模成功的基礎(chǔ)上兼有陰虛癥狀[8-10]:(1)病理上出現(xiàn)多巴胺神經(jīng)元的丟失；(2)小鼠出現(xiàn)運動遲緩、震顫、僵直等神經(jīng)行為學(xué)癥狀；(3)小鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯，舌象紅，小便量少色黃，大便干燥等癥狀。

1.2.2 復(fù)方地黃顆粒制備及給藥

復(fù)方地黃顆粒(Compound Dihuang Granule，CDG)，由熟地黃，白芍，鉤藤，珍珠母，丹參，石菖蒲，全蝎組成，由國家中藥工程技術(shù)研究中心制備。

小鼠每日用量:參考《定量藥理學(xué)》(孫瑞元.《定量藥理學(xué)》北京:人民衛(wèi)生出版社，1987 ∶247)計算。 小鼠每日用量=標(biāo)準(zhǔn)體重成人每日用量× 1/388。

治療組小鼠造模后按10 g/kg 劑量給予復(fù)方地黃顆粒灌胃，其它小鼠給予同等劑量的生理鹽水灌胃，每日 1 次，給藥 1 周。

1.2.3 行為學(xué)檢測

曠場實驗(open field test):曠場實驗在30 cm ×30 cm 的曠場中進(jìn)行。 實驗前小鼠先適應(yīng)環(huán)境1 h，開始時將小鼠放于曠場中心，攝像頭記錄小鼠運動情況5 min。 實驗后得到實時錄像，分析其距離中心點的運動距離及中心區(qū)域的停留時間。

爬桿實驗(pole test):將小鼠頭朝上置于桿上，訓(xùn)練小鼠學(xué)會掉頭以及爬完全桿路程，每只小鼠訓(xùn)練3 次，每次間隔1 h。 記錄各組小鼠治療后掉頭時間以及爬完全程所用時間，每只小鼠測試3 次，取平均值為最終結(jié)果。

各組小鼠造模前連續(xù)3 d 進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練，治療結(jié)束后對其進(jìn)行行為學(xué)檢測。

1.2.4 微舌象采集

運用 MoticSMZ-171 體視顯微鏡，Motic Images Plus 3.0(×64)軟件，治療結(jié)束后，在同一光源下進(jìn)行小鼠舌苔的拍攝。 將所拍攝照片輸入電腦，采用Adobe Photoshop.2020.圖像軟件。 圖像舌面從舌尖到舌根均等分為5 等份，取中間1/5 的面積作為舌象的量化分析域[11]，讀取 R1、G1、B1[12](分別代表紅、藍(lán)、綠三種基本顏色)數(shù)值，分別進(jìn)行紅色度R的計算:R=R1/(R1+G1+B1)、綠色度G 計算:G=G1/(R1+G1+B1)和藍(lán)色度B 的計算:B=B1/(R1+G1+B1)。

1.2.5 環(huán)核苷酸含量檢測

各組小鼠取血，靜置2 h 后，-4℃狀態(tài)下離心(3000 rpm，10 min)，取上清液-80℃冰箱保存待測。ELISA 法檢測各組小鼠中環(huán)核苷酸，環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophos-phate，cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)含量，并計算cAMP/cGMP 值。

1.2.6 多巴胺能神經(jīng)元損傷評估

小鼠紋狀體裝離心管放液氮中，-80℃冰箱保存，Western Blot 法檢測小鼠紋狀體中酪氨羥化酶(TH)蛋白表達(dá)水平。 灌流后取小鼠全腦，放入4%多聚甲醛固定，分別經(jīng)20%蔗糖、30%蔗糖脫水后冰凍切片機(jī)切片，取小鼠黑質(zhì)層面進(jìn)行免疫組化(immunohistochemistry，IHC)法檢測陽性TH+多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用GraphPad Prism 8 軟件統(tǒng)計，實驗數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-way analysis of variance，One-way ANOVA)，或雙因素方差分析(Two-way analysis of variance，Two-way ANOVA)，P＜ 0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)檢測

小鼠的運動軌跡顯示，與正常組相比，模型組小鼠運動距離減少，中心區(qū)域停留時間增加，經(jīng)治療后，運動、探索能力得到改善，差異具有顯著性(P＜0.001)。 模型組小鼠的反應(yīng)力較正常組減弱，運動遲緩，具體表現(xiàn)在轉(zhuǎn)頭時間、爬桿時間明顯增加，經(jīng)過治療后運動能力改善(P＜0.001)(見圖1)。

圖1 各組小鼠行為學(xué)檢測Note. A. Trajectory map of mice. B. Open field test. C. Pole test. Compared with the normal group，※※※P ＜ 0.001. Compared with the model group，***P ＜ 0.001.(The same in the following figures)Figure 1 Behavioral test of mice in each group

2.2 小鼠微舌象及舌色度值分析

經(jīng)舌色度值分析發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠相比，模型組小鼠舌色紅色度值比例明顯升高，綠色度值比值G、藍(lán)色度比值 B 明顯低于正常組小鼠(P＜0.01)。 與模型組相比，治療組小鼠舌色紅色度值比例明顯降低，綠色度值比值G、藍(lán)色度比值B 升高(P＜ 0.01)(見圖2)。

圖2 小鼠微舌象及舌色度值分析結(jié)果Note. Compared with the model group，**P ＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Analysis of microscopic tongue image and chromaticity value of tongue color in mice

2.3 環(huán)核苷酸(cAMP、cGMP)表達(dá)

與正常組相比，模型組小鼠血清中cAMP 明顯升高(P＜ 0.001)，而 cGMP 顯著下降(P＜ 0.001)，且模型組cAMP/cGMP 比值明顯高于正常組(P＜0.001)。 經(jīng)過治療后，cAMP 下降，cGMP 升高，其比值較模型組明顯降低(P＜0.05)(見圖3)。

圖3 環(huán)核苷酸表達(dá)及比值Note. Compared with the model group，*P ＜ 0.05.(The same in the following figures)Figure 3 cAMP、cGMP expression and ratio

2.4 多巴胺能神經(jīng)元損傷評估

IHC 顯示，與正常組相比，模型組小鼠黑質(zhì)致密部TH+陽性多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少(P＜0. 001)，經(jīng)治療后，其含量顯著增加(P＜0. 01，n= 3)。 模型組小鼠紋狀體內(nèi) TH 蛋白表達(dá)明顯低于正常組，治療后含量增加(P＜0. 01，n= 3)(見圖4)。

圖4 酪氨酸羥化酶表達(dá)Note. A. Expression of TH in SNpc. B. Expression of TH in striatum. Compared with the normal group，※P ＜ 0.05.Figure 4 Expression of TH

3 討論

PD 是第二大神經(jīng)退行性疾病，病因多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[13]，中醫(yī)將其歸屬于“顫證”范疇。 西藥短期內(nèi)對改善PD 癥狀有效，但長期使用副作用較多，不能緩解患者病情，嚴(yán)重影響了其臨床運用的順從性。 中醫(yī)治療PD 強(qiáng)調(diào)辨證論治，早期中醫(yī)藥的干預(yù)可扼發(fā)病之勢[14]，中晚期協(xié)同西藥增效減毒，避免、緩解并發(fā)癥狀[15-16]。 何建成教授認(rèn)為，“虛”“瘀”“痰”“毒”貫穿 PD 發(fā)病總過程，肝腎陰虛，臟腑功能失調(diào)為本，肝風(fēng)、痰濁、瘀熱、毒聚絡(luò)損為實[17]。 何建成教授研制的復(fù)方地黃顆粒(CDG)具有補(bǔ)腎養(yǎng)肝，息風(fēng)止顫，化痰活血，通絡(luò)解毒之功。 臨床運用CDG 能改善PD 患者癥狀，聯(lián)合西藥美多芭“增效減毒”，對PD 患者有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[18]。

病證結(jié)合動物模型是現(xiàn)階段中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的重要載體[19]。 神經(jīng)毒素 MPTP 制備 PD 小鼠動物模型是目前研究者常用的建模方法[20]。 MPTP能通過血腦屏障，生成代謝產(chǎn)物MPP+，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和ATP 生成的減少，造成多巴胺能神經(jīng)元死亡[21]。 課題組前期運用MPTP 腹腔注射制備PD 陰虛動風(fēng)證小鼠模型[10]。 本實驗進(jìn)一步從小鼠的病因、行為學(xué)、舌象等對該模型進(jìn)行驗證，在此基礎(chǔ)上探討CDG 治療PD 陰虛動風(fēng)證小鼠的作用機(jī)理。 結(jié)果顯示:造模后小鼠病理顯示多巴胺能神經(jīng)元丟失，同時具備PD陰虛證的典型癥狀。 如造模后小鼠TH 表達(dá)減少，出現(xiàn)顫動、運動遲緩、抓握能力較差、便秘、毛色干枯、舌紅、小便量少、大便干燥等癥狀。 給予CDG 治療后，小鼠舌紅色度值明顯降低(P＜0.01)，運動綜合能力得到顯著改善(P＜0.001)，TH 表達(dá)增加(P＜0.01)。 這說明CDG 在一定程度上能改善小鼠陰虛癥狀，減輕小鼠多巴胺神經(jīng)元的損傷。

環(huán)核苷酸(cAMP、cGMP)可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，與機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能密切相關(guān)[22]。 本研究對小鼠血清中環(huán)核苷酸測定，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中cAMP 明顯升高，cGMP 顯著下降。 已有的研究表明，cAMP、cGMP 兩者作用常具有拮抗性，類似于中醫(yī)陰陽相互制約的關(guān)系，多數(shù)的研究將其作為判斷中醫(yī)陰虛、陽虛證候的關(guān)鍵指標(biāo)之一[23-24]。 本研究中 cAMP/cGMP 比值明顯高于正常組(P＜0.001)，提示本模型具有陰虛特性。 給予CDG 干預(yù)之后，血清cAMP 明顯下降，cGMP 升高，兩者比值降低(P＜0.001)。 提示CDG 可能通過調(diào)節(jié)血清環(huán)核苷酸(cAMP、cGMP)含量改善小鼠陰虛的癥狀。

PD 發(fā)生的根本原因在于黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失[25]。 TH 為多巴胺合成的限速酶，MPTP 在體內(nèi)形成的代謝產(chǎn)物能抑制TH 的活性降低多巴胺含量[26]，因此，TH 含量在一定程度上反映了多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量[27]。 本研究分別用IHC、Western Blot 法檢測小鼠黑質(zhì)、紋狀體中TH 含量，結(jié)果顯示，模型組小鼠黑質(zhì)中陽性TH+多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，紋狀體內(nèi)TH 蛋白水平表達(dá)降低(P＜0.01)，治療后，兩者表達(dá)皆明顯增加(P＜0.01)，這表明CDG 能修復(fù)PD 陰虛動風(fēng)證小鼠損傷的多巴胺能神經(jīng)元。

綜上，本研究進(jìn)一步從PD 小鼠病因、癥狀、客觀指標(biāo)檢測、以方測證等方面驗證該模型的中醫(yī)證候?qū)傩?，本模型可靠、穩(wěn)定。 復(fù)方地黃顆粒，方以補(bǔ)腎養(yǎng)肝為主，祛痰、化瘀、解毒為輔，其治療切中帕金森病的根本病機(jī)。 本研究證實復(fù)方地黃顆粒治療PD 陰虛動風(fēng)證小鼠療效顯著，能調(diào)節(jié)血清中環(huán)核苷酸含量，有效修復(fù)損傷的多巴胺神經(jīng)元。