經(jīng)爭輝，李春英，劉蓉，任俞華，崔詩雨，趙文寶，張海峰*

(1. 西安交通大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院遺傳與發(fā)育研究所，西安 710100； 2. 西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，西安710061； 3. 浙江省麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000； 4. 陜西省西安市高陵區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710299)

電壓門控氯離子通道3(chloride voltage-gated channel 3，Clcn3)在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，主要分布于細(xì)胞膜、胞漿，細(xì)胞核內(nèi)少量分布；小鼠體內(nèi)共有4 種不同的Clcn3 亞型，分別為Clcn3a，Clcn3b，Clcn3c，Clcn3e，其主要區(qū)別是不同亞型的Clcn3 蛋白N 端和C 端氨基酸序列不同[1]。 容積調(diào)控性陰離子通道(volume-regulated anion channel，VRAC)是一類具有種屬、組織細(xì)胞差異性的功能蛋白復(fù)合體。Clcn3 被認(rèn)為是一種潛在 VRAC 候選蛋白，其胞膜組份對(duì)保持特定組織細(xì)胞體積平衡至關(guān)重要[2-4]；多數(shù)Clcn3 分布于胞漿內(nèi)，位于溶酶體膜上的Clcn3 作為2Cl-/H+交換體，降低溶酶體內(nèi)pH 值使其酸化，從而維持溶酶體系統(tǒng)的正常生物學(xué)功能[5]；胞核內(nèi)Clcn3 功能研究少見報(bào)道。 亞細(xì)胞分布的Clcn3 通過復(fù)雜的分子機(jī)制，參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、分化、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程[6-13]，在腫瘤[14]、免疫[15]、炎癥[16]、神經(jīng)[17]、生殖[18]、心血管[19]等相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其可作為相關(guān)疾病診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

基因編輯動(dòng)物是研究基因與人類疾病發(fā)生關(guān)系的有效動(dòng)物模型，通過構(gòu)建Clcn3 基因敲除動(dòng)物，有助于揭示其參與相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。本研究旨在收集Clcn3+/+、Clcn3+/-及Clcn3-/-小鼠的心、肝、脾、腎、肺和腦等主要實(shí)質(zhì)器官組織，觀察Clcn3 缺失對(duì)主要實(shí)質(zhì)器官大體和組織結(jié)構(gòu)的影響，為以Clcn3 敲除小鼠為模型動(dòng)物的科學(xué)實(shí)驗(yàn)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Clcn3 基因敲除FVB SPF 級(jí)小鼠由中國蘇州賽業(yè)生物公司【SCXK(蘇)2018-0003】通過CRISPR-cas9 技術(shù)生產(chǎn)。 簡要步驟如下:靶向小鼠Clcn3 的sgRNA 和cas9 mRNA 共同注射到雌性小鼠的受精卵中，經(jīng)胚胎移植生產(chǎn)Clcn3-/-小鼠(gRNA1:GATTTATTTAACCCTAATGAAGG和gRNA2:AATGGGCTGTATTGTCCTCCTGG)； 將Clcn3-/-與Clcn3+/+小鼠交配，繁殖雜合子小鼠；后代Clcn3-/-小鼠由雜合子Clcn3+/-小鼠自交繁殖。Clcn3+/-小鼠飼養(yǎng)(深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院鄧志欽饋贈(zèng))在西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的SPF 級(jí)動(dòng)物房【SYXK(陜)2018-001】。 本實(shí)驗(yàn)使用 15 只 SPF 級(jí) FVB 小鼠，3 周齡，體重約為6 ～12 g，其中野生型、雜合子和純合子小鼠各5 只。 飼養(yǎng)環(huán)境:屏障環(huán)境、獨(dú)立換氣；晝夜光照各半，濕度恒定；自由采食和飲水。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)要求(2021-1499)。

1.1.2 主要試劑與儀器

引物合成(擎科生物，中國)，蛋白酶K(天根生物，RT403，中國)，2X Taq Master Mix(蘇州近岸蛋白質(zhì) 科 技， E005-01B， 中 國)， TritonX-100 (Thermo Fisher，85111，美國)，100 bp DNA ladder(天根生物，MD109，中國)，Tris(博奧拓達(dá)，T6061，中國)，瓊脂糖(天根生物，RT101，中國)。 干式恒溫器(合眾生物， GH-100， 中 國)， 凝 膠 電 泳 儀 ( BIO-RAD，1704469，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，ChemiDoc MP，美國)，輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(瑞沃德，S700A，中國)，全自動(dòng)數(shù)字病理掃描分析系統(tǒng)(江豐生物，KFPRO-002，中國)，PCR 儀(BIO-RAD，T100，美國)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定

(1)小鼠基因組DNA 提取:小鼠出生后2 ～3周，剪取鼠尾2 ～3 mm 放入1.5 mL 離心管中，加入100 μL 裂 解 液 (1.37 g KCl， 1.2 g Tris， 1 mL TritonX-100，溶于1 L 純水中，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH= 9.0)和4 μL 的蛋白酶 K，56℃過夜裂解。 裂解完成后，98℃金屬浴加熱 15 min 終止裂解。 10 000 rpm 離心 15 min，取上清，即可得到小鼠基因組DNA。

(2)小鼠基因型鑒定:小鼠基因型均通過PCR進(jìn)行鑒定。 PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，其中 2 × Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，基因組 DNA 3 μL，純水 7.5 μL。 PCR 鑒定小鼠基因型共需要3 條引物，引物的序列信息如表1 所示。 PCR 反應(yīng)條件為:預(yù)變性94℃ 1 min 30 s；變性94℃ 20 s，退火 65℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，循環(huán) 30次；72℃ 5 min；4℃ 保存。 取 10 μL PCR 產(chǎn)物加入到2%瓊脂糖凝膠中，100 V 電泳40 min 后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，分析小鼠的基因型。 F1、R1 用來擴(kuò)增突變的Clcn3 基因，產(chǎn)物大小為 654 bp；F2、R1 用來擴(kuò)增正常的Clcn3 基因，產(chǎn)物大小為769 bp。

表1 小鼠基因型鑒定所使用的引物序列Table 1 Primers sequence for genotyping identification of mouse

1.2.2 小鼠樣品采集

小鼠出生后，母鼠喂養(yǎng)至3 周齡，脫頸處死，剪開小鼠的胸腔和腹腔，采集小鼠的心、肝、脾、腎、肺和腦組織。 采集的小鼠組織器官用PBS 沖洗干凈后，擺放在具有標(biāo)尺的手術(shù)布上拍照，利用Image J軟件測量小鼠各器官的面積。 拍照完畢后，將小鼠器官放入10%福爾馬林溶液中常溫保存，用于制作石蠟切片。

1.2.3 石蠟切片制作及HE 染色

小鼠組織器官浸入10%中性福爾馬林溶液(10倍體積)固定24 h 后，利用不同濃度梯度的乙醇溶液進(jìn)行脫水處理，步驟為:70%、80%和90%的乙醇溶液分別脫水2 h；95%和100%的乙醇溶液分別浸泡脫水1 h。 接著，將小鼠器官放入100%二甲苯溶液內(nèi)透明30 min 后，浸蠟包埋:將透明好的小鼠器官放入石蠟二甲苯混合液中(1 ∶1)30 min，然后浸入石蠟Ⅰ和Ⅱ中各2 h。 包埋好的小鼠組織利用切片機(jī)切片，切片厚度為4 μm。 石蠟切片脫蠟后，利用蘇木素伊紅染液行HE 染色。 樹膠封片后，利用病理數(shù)字切片系統(tǒng)掃描HE 切片，KIBIO.SlideViewer軟件觀察不同基因型小鼠主要實(shí)質(zhì)器官細(xì)微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定

三引物PCR 法鑒定野生型(Clcn3+/+)、雜合子(Clcn3+/-)及純合子(Clcn3-/-)FVB 小鼠；F1、R1 引物靶向擴(kuò)增經(jīng)CRISPR-CAS9 編輯過的Clcn3 基因，產(chǎn)物大小為 654 bp，F(xiàn)2、R1 引物靶向擴(kuò)增正常的Clcn3 基因，產(chǎn)物大小為 769 bp(表 1)。 如圖 1 所示，利用 F1、R1 和 F2 擴(kuò)增鼠尾 DNA，1 和 3 號(hào)小鼠只出現(xiàn)654 bp 的條帶，為純合子小鼠；12 和13 號(hào)小鼠經(jīng)3 條引物擴(kuò)增后只出現(xiàn)了769 bp 的條帶，為野生型小鼠；其他小鼠經(jīng)3 條引物擴(kuò)增后同時(shí)出現(xiàn)了654 bp 和769 bp 的條帶，為雜合子小鼠。

圖1 部分小鼠的基因型鑒定結(jié)果Note. A. The product size of amplification using primer F1 and R1(654 bp).B. The product size of amplification using primer F2 and R1(769 bp).Figure 1 Genotype results of mice identification

2.2 Clcn3 敲除對(duì)小鼠體重的影響

如圖2A 所示，Clcn3-/-小鼠頭、體、尾、毛發(fā)、四肢、耳、鼻、口、眼等器官未見明顯畸形。Clcn3 敲除小鼠生長明顯緩慢，3 周齡的Clcn3-/-小鼠體型明顯小于Clcn3+/+和Clcn3+/-小鼠。Clcn3+/+與Clcn3+/-小鼠的體重差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于Clcn3-/-小鼠的體重(P＜ 0.05)，野生型、雜合子、純合子小鼠3 周齡時(shí)的平均體重分別為10.4、10.2 和5.9 g(圖2B)。

圖2 不同基因型小鼠3 周齡時(shí)的外形體征及體重Note. A. Physical features of different genotypes mice at 3 weeks. B. Body weight of different genotypes mice at 3 weeks. Compared with Clcn3+/+or Clcn3+/- mice，**P ＜ 0.05.(The same in the following figures)Figure 2 Physical features and body weight of different genotypes mice at 3 weeks

2.3 Clcn3 敲除對(duì)小鼠實(shí)質(zhì)器官面積的影響

為進(jìn)一步剖析Clcn3-/-小鼠生長緩慢和體型矮小之因，我們觀察了小鼠主要實(shí)質(zhì)器官的發(fā)育狀況。 3 周齡小鼠處死后，采集心、肝、脾、肺、腎、腦等組織并拍照，利用Image J 軟件測量其面積。 如圖3所示，Clcn3+/+和Clcn3+/-小鼠的心臟、肝、脾、肺、腎等器官的投影面積差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著大于Clcn3-/-小鼠(P＜0.05)；脾變化最為明顯，野生型和雜合子小鼠的脾平均面積為53.6 mm2和50.1 mm2，而Clcn3 敲除的純合子小鼠的脾面積只有25.5 mm2，減少了將近50%。 此外，不同基因型小鼠腦組織的面積沒有顯著差異(P＞0.05)。 以上數(shù)據(jù)提示Clcn3 敲除會(huì)導(dǎo)致幼齡小鼠主要實(shí)質(zhì)器官減小。

圖3 不同基因型小鼠3 周齡時(shí)的實(shí)質(zhì)器官面積Figure 3 Parenchymal organs area of different genotypes mice at 3 weeks

2.4 Clcn3 敲除對(duì)小鼠實(shí)質(zhì)器官微觀結(jié)構(gòu)的影響

Clcn3-/-小鼠生長緩慢，體型矮小，主要實(shí)質(zhì)器官體積明顯減小。 HE 染色小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織切片，觀察Clcn3 敲除對(duì)小鼠主要實(shí)質(zhì)器官組織結(jié)構(gòu)的影響。 如圖4 所示，不同基因型小鼠心臟的心肌纖維呈柱狀，卵圓形細(xì)胞核位于心肌細(xì)胞中央，沒有發(fā)生明顯變化；與Clcn3+/+和Clcn3+/-小鼠相比，Clcn3-/-小鼠單位面積上的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增多提示Clcn3-/-小鼠心肌細(xì)胞的體積變小。 小鼠肝的HE 染色切片顯示:不同基因型小鼠的肝結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞核大而圓。 敲除Clcn3 導(dǎo)致小鼠脾紅髓和白髓的面積相對(duì)變小，脾結(jié)構(gòu)組成未見明顯變化。 小鼠肺組織切片HE 染色顯示:與Clcn3+/+、Clcn3+/-小鼠相比，Clcn3-/-小鼠的肺泡壁明顯變薄，細(xì)胞數(shù)量減少。Clcn3-/-小鼠腎基本結(jié)構(gòu)健全，腎小球血管球發(fā)育不全，即細(xì)胞聚集、毛細(xì)血管袢不明顯。 不同基因型小鼠的腦組織結(jié)構(gòu)未見明顯改變。

圖4 不同基因型小鼠實(shí)質(zhì)器官的HE 染色Figure 4 Parenchymal organs HE staining of mice

3 討論

Clcn3 廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的各種組織細(xì)胞中，在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、分化、生殖、腦發(fā)育以及心血管疾病中等方面具有重要的作用[11，18-22]。Clcn3 基因編輯動(dòng)物是探討其功能、參與相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理性動(dòng)物模型。 黃雪蓮等[23]利用Clcn3 敲除小鼠研究匹伐他汀藥物降脂作用的機(jī)制。 Xiong 等[24]利用基因編輯技術(shù)生產(chǎn)的小鼠在心肌細(xì)胞中特異性高表達(dá)Clcn3，為研究Clcn3 在心臟中的作用提供了理想的動(dòng)物模型。 利用基因編輯模式動(dòng)物探討Clcn3 基因的功能雖已被廣泛報(bào)道，但Clcn3 基因敲除對(duì)小鼠實(shí)質(zhì)器官的影響還未被系統(tǒng)闡述，尤其是幼齡小鼠。 本實(shí)驗(yàn)采集了野生型、雜合子以及Clcn3 敲除的純合子小鼠的心臟、肝、脾、肺、腎和腦組織，系統(tǒng)分析Clcn3 基因敲除對(duì)幼齡小鼠實(shí)質(zhì)器官大小和組織結(jié)構(gòu)的影響。

本實(shí)驗(yàn)未使用成年小鼠，均使用3 周齡的幼齡小鼠，可排除因分籠、飲食等外界因素干擾，進(jìn)而更準(zhǔn)確反映Clcn3 敲除對(duì)小鼠實(shí)質(zhì)器官發(fā)育的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Clcn3 敲除的純合子小鼠在3 周齡時(shí)的體重顯著低于野生型和雜合子的體重，這與潘萌等[1]所描述的一致。 測量不同基因型小鼠實(shí)質(zhì)器官的面積后發(fā)現(xiàn)，Clcn3-/-小鼠心、肝、脾、肺、腎的面積顯著小于野生型和雜合子小鼠，提示Clcn3-/-小鼠主要實(shí)質(zhì)器官發(fā)育遲緩、體積小是小鼠體重明顯降低的主要原因之一。 不同基因型3 周齡小鼠腦面積無顯著差異，推測:腦作為動(dòng)物最重要的器官，在動(dòng)物器官未發(fā)育完全之前，機(jī)體會(huì)優(yōu)先供應(yīng)腦發(fā)育之需。 總之，本研究發(fā)現(xiàn)Clcn3 基因敲除小鼠的實(shí)質(zhì)器官顯著減小。

利用器官組織切片HE 染色，我們進(jìn)一步觀察了Clcn3 敲除對(duì)小鼠主要實(shí)質(zhì)器官組織結(jié)構(gòu)的影響。 HE 染色結(jié)果提示Clcn3 基因敲除未影響小鼠心臟的結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞變?。籆lcn3 敲除未影響小鼠脾和腎的結(jié)構(gòu)組成，但明顯減小了小鼠脾紅髓和白髓的體積以及腎毛細(xì)血管球的體積；Clcn3-/-小鼠肺泡壁明顯變薄，細(xì)胞數(shù)量減少；Clcn3-/-小鼠肝和腦組織結(jié)構(gòu)未見明顯改變，而Stobrawa 等[22]發(fā)現(xiàn)干擾Clcn3 表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠的海馬區(qū)在7 月齡時(shí)消失，而本實(shí)驗(yàn)的腦組織HE 切片顯示3 周齡小鼠的腦組織結(jié)構(gòu)并沒有產(chǎn)生明顯改變，這提示我們Clcn3 敲除導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)丟失可能是一個(gè)漸進(jìn)的過程。 綜上所述，敲除Clcn3 不會(huì)造成小鼠實(shí)質(zhì)器官結(jié)構(gòu)組成改變，但會(huì)導(dǎo)致小鼠實(shí)質(zhì)器官的結(jié)構(gòu)或細(xì)胞體積減小，這是導(dǎo)致Clcn3 敲除小鼠實(shí)質(zhì)器官面積和體重顯著降低的主要原因之一。Clcn3 通過何種機(jī)制影響細(xì)胞生長、延緩器官發(fā)育，有待運(yùn)用高通量測序、翻譯后修飾、基因組、蛋白組學(xué)等多種技術(shù)手段更加深入地探討研究。

基因修飾動(dòng)物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛，例如發(fā)病機(jī)制探究，藥物篩選等[25]。 本實(shí)驗(yàn)探究了Clcn3 敲除對(duì)小鼠實(shí)質(zhì)器官的影響，發(fā)現(xiàn)敲除Clcn3 會(huì)導(dǎo)致幼齡小鼠的實(shí)質(zhì)器官減小，但未對(duì)幼齡小鼠實(shí)質(zhì)器官產(chǎn)生明顯的病理損傷，可以為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供理論參考。

4 結(jié)論

Clcn3 基因敲除會(huì)降低幼齡小鼠體重和實(shí)質(zhì)器官的大小，但未對(duì)幼齡小鼠實(shí)質(zhì)器官產(chǎn)生明顯的病理損傷。