王曉萌，周慧敏，董奕彤，陳勝男，安鐵洙，殷萍，王春生*

(1. 東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040； 2. 黑龍江省醫(yī)院，哈爾濱 150040)

外源基因的組織特異性表達在研究基因功能、細胞分化以及再生醫(yī)學等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。 組織特異性啟動子是調(diào)控基因表達的“開關(guān)”，可實現(xiàn)外源基因在某些部位進行特異表達[1]。 骨骼肌具有生命周期長，操作方便，合成的蛋白容易進入體循環(huán)的特點[2-4]，是基因治療及動物模型構(gòu)建的理想靶點，但肌肉特異載體的低表達水平限制了肌肉作為靶點的可能性。 因此，選擇高轉(zhuǎn)錄效力的肌肉特異啟動子尤為重要。 α-actin 是一種天然的骨骼肌啟動子，可在骨骼肌細胞中特異表達，而在其他非肌肉細胞中幾乎沒有活性[5]，但是由于受多種因素的影響，α-actin 的轉(zhuǎn)錄活性不穩(wěn)定[6]。1999 年，Li 等[7]在對 α-actin 啟動子和肌肉增強子的結(jié)構(gòu)進行分析后，對肌肉特異性調(diào)控元件進行了重排與組裝，合成包含 MEF-1、MEF-2、SRE 和TEF-1四種作用元件的肌肉特異啟動子SP，其轉(zhuǎn)錄活性是α-actin 的 4 ～ 5 倍。 2021 年，Malerba 等[8]將 SP 啟動子調(diào)控的抗肌萎縮蛋白MD1 腺病毒載體注射到肌萎縮小鼠模型中，SP 啟動子驅(qū)動了MD1 在小鼠心肌中的高水平表達。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細菌和古細菌抵御外來遺傳物質(zhì)的一種獲得性免疫防御機制[9]，包括能識別靶基因的CRISPR 序列和具有核酸酶活性的相關(guān)蛋白兩個部分。 研究最為深入的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已被廣泛運用于轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建[10-13]。 在該系統(tǒng)中，sgRNA(single guide RNA)中存在一段與靶點PAM 序列(NGG)上游互補的序列，可引導Cas9 結(jié)合至靶位點，對靶DNA 的PAM 序列上游3 個堿基的位置進行切割使其雙鏈斷裂(DSB)[14]。 雙鏈斷裂的修復通過非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR)兩種機制來實現(xiàn)。 因此，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，并提供外源基因同源載體作為HDR 的“原料”，即可實現(xiàn)外源基因的定點敲入。

利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)和組織特異啟動子，可進行組織特異的基因編輯。 為構(gòu)建肌肉特異表達Cas9 小鼠模型，本研究選取小鼠Rosa26 位點作為打靶位點，構(gòu)建SP 啟動子驅(qū)動的肌肉特異性表達Cas9 示蹤同源打靶載體。 同時，這一研究也為構(gòu)建疾病模型和基因疾病的相關(guān)治療提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株，載體和細胞

感受態(tài)細胞DH5α(Cat# DL1001)購于上海唯地生物技術(shù)有限公司。 PX459-Rosa26 載體為實驗室自存載體(載體上已連接 Rosa26 位點的sgRNA)。 Rosa26 供體載體購于廣州易錦生物技術(shù)有限公司(Cat# DC-DON-SH02)。 載體詳細信息見圖1。 C2C12 細胞和293T 細胞為實驗室前期凍存細胞。

圖1 載體示意圖Figure 1 Diagram of plasimd

1.1.2 主要試劑與儀器

2×Vazyme LAmp Master Mix(Vazyme，P312-01)，2 × ES Taq Master Mix(CWBIO，CW0690)，Endo-free Plasmid Mini Kit II(Omega，D6950-01)，Gel Extraction Kit (CWBIO，CW2302M)，Lipfectamine 2000(Invitrogen，11668030)，GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo， K0721)， T4 DNA Ligase(TAKARA，2011A)，T7 Endonuclease I 酶(NEB，E3321)，同源重組酶(Vazyme，C112-01)，限制性內(nèi)切 酶KpnI ( Promega， R6341)，AgeI ( Promega，R7251)，XbaI(Promega，R6181)，EcoRI(Promega，R6011)，MluI (Promega， R6381)，BstBI (Thermo，ER0121)。

PCR 儀(Applied Biosystems，9700，美國)，分光光度計(Thermo，NanoDrop 2000，美國)，倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss，Axiovert 200，德國)，CCD 成像系統(tǒng)(Nikon，DS-Fi1，日本)，離心機(Beckman Coulter，Microfuge 16，美國)。

1.2 方法

1.2.1 肌肉特異性表達Cas9 載體的構(gòu)建

(1)SP 啟動子的合成與PCR 擴增:SP 序列參照Li 等[7]的報道，由南京金斯瑞生物科技公司合成后連接于 pUC57 載體，測序正確的載體命名為pUC57-SP。 利用Primer 5 軟件設(shè)計SP 啟動子上下游引物并命名為SP-F 和SP-R(引物序列見表1)，在上下游引物的5’端分別引入KpnI 和AgeI 的酶切位點，引物交由哈爾濱睿博興科生物技術(shù)有限公司合成(本研究所用引物均由該公司合成)。 以載體pUC57-SP 為模板，進行 SP 啟動子的 PCR 擴增。 反應(yīng)組成:模板 10 ng，SP-F 1 μL，SP-R 1 μL，2 × ES Taq Master Mix 12.5 μL，補加 ddH2O 至 25 μL。PCR 反應(yīng)程序:95℃ 5 min(預變性)；95℃ 30 s(變性)，62℃ 30 s(退火)，72℃ 90 s(延伸)，共 31 個循環(huán)；72℃ 7 min(終延伸)。 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后對目的條帶進行膠回收。

(2) PX459-Rosa26-SP 的連接:PX459-Rosa26為連有打靶Rosa26 位點sgRNA 的 PX459 載體。 采用KpnI 和AgeI 分別對 SP 啟動子擴增片段與PX459-Rosa26 載體雙酶切，電泳檢測后對目的條帶進行膠回收。 將上述獲得的載體長片段和SP 啟動子進行連接，反應(yīng)組成:SP 回收產(chǎn)物40 ng，PX459-Rosa26 回收產(chǎn)物 100 ng，T4 DNA 連接酶 0.5 μL，10 × Buffer 1 μL，補加 ddH2O 至 10 μL。 連接條件為4℃ 16 h。 連接產(chǎn)物使用感受態(tài)細胞DH5α 進行轉(zhuǎn)化，挑取單個菌落進行培養(yǎng)，按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書對菌液進行提取，所得質(zhì)粒經(jīng)KpnI 和AgeI酶切鑒定后送至哈爾濱睿博興科生物技術(shù)有限公司測序(本研究所有測序均由該公司完成)。

1.2.2 PX459-Rosa26-SP 在C2C12 細胞中編輯活性檢測

(1)細胞轉(zhuǎn)染與DNA 的提取:C2C12 細胞培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2飽和濕度。 傳代后，待細胞融合度達到60% ～70%，使用Lipfectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PX459-Rosa26 或PX459-Rosa26-SP 載體，未轉(zhuǎn)染的C2C12 細胞作為對照組。 轉(zhuǎn)染72 h 后，提取C2C12 細胞 DNA。

(2)打靶位點的 PCR 擴增:Rosa26 序列中，XbaI 酶切位點為PX459-Rosa26-SP 打靶位點，利用Primer 5 軟件在XbaI 酶切位點左右為207 bp 和398 bp 處設(shè)計引物并命名為 mRosa26-XbaI-F1 和mRosa26-XbaI-R1(引物序列見表1)，擴增產(chǎn)物理論值為 600 bp。 對 C2C12 DNA 進行 PCR 擴增，電泳檢測后對目的條帶進行膠回收。

(3)編輯效率檢測:采用兩種方法檢測SP 啟動子和CMV 啟動子帶動 Cas9 蛋白的編輯效率。 對PCR 產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶XbaI 酶切檢測。 反應(yīng)組成:XbaI 0.5 μL，PCR 膠回收產(chǎn)物 200 ng，10 × FD Buffer 1 μL，補加 ddH2O 至 10 μL。 酶切條件為 37℃1 h。 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切情況。

對PCR 產(chǎn)物進行 T7E1 酶切檢測。 PCR 產(chǎn)物退火 雜 交， 反 應(yīng) 組 成: PCR 產(chǎn) 物 200 ng， 10 ×NEBuffer2 2 μL，補加 Nuclease-free Water 至 19 μL。退火雜交條件:95℃ 5 min(預變性)；95 ～85℃，-2℃ /s；85 ～ 25℃，-0.1℃ /s(條件降溫)。 雜交后的產(chǎn)物經(jīng)T7E1 酶切鑒定。 反應(yīng)組成:退火反應(yīng)產(chǎn)物 19 μL，T7E1 1 μL。 酶切條件為 37℃水浴 15 min后加入 0.25 mol/L 的 EDTA 1.5 μL 終止反應(yīng)。 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切情況。

1.2.3 PX459-Rosa26-SP-DsRed 示蹤載體的構(gòu)建

(1)T2A-DsRed 片段的PCR 擴增:根據(jù)實驗室保存的含有T2A-DsRed 的載體序列，利用Primer 5軟件設(shè)計T2A-DsRed 上下游引物并命名為T2ADsRed-F 和 T2A-DsRed-R，引物 5’端引入同源臂(引物序列見表 1)。 通過 PCR 進行 T2A-DsRed 的擴增。 反應(yīng)組成:T2A-DsRed-F 1 μL，T2A-DsRed-R 1 μL，模板10 ng，2 × ES Taq Master Mix 12.5 μL，補加 ddH2O 至 25 μL。 反應(yīng)程序:95℃ 5 min(預變性)；95℃ 30 s(變性)，62℃ 30 s(退火)，72℃ 45 s(延伸)，共 32 個循環(huán)；72℃ 7 min(終延伸)。 電泳檢測后對目的條帶進行膠回收。

(2)PX459-Rosa26-SP-DsRed 的連接:將得到的T2A-DsRed 片段與經(jīng)EcoRI 酶切后的 PX459-Rosa26-SP 載體進行同源重組。 反應(yīng)組成:T2ADsRed 片段 20 ng，PX459-Rosa26-SP 載體大片段 80 ng，Exnase Ⅱ 1 μL，5 × CE Ⅱ Buffer 2 μL，補加ddH2O 至 10 μL。 同源重組條件為 37℃ 30 min，立即至于冰上冷卻。 同源重組產(chǎn)物使用感受態(tài)細胞DH5α 進行轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒后測序。

1.2.4 PX459-Rosa26-SP-DsRed 示蹤載體的檢測

按1.2.2 中的條件和方法對C2C12 細胞進行培養(yǎng)和PX459-Rosa26-SP-DsRed 載體的轉(zhuǎn)染，設(shè)置未轉(zhuǎn)染的C2C12 細胞作為對照組。 48 h 后，觀察熒光表達情況。

1.2.5 肌肉特異表達Cas9 同源打靶示蹤載體的構(gòu)建

(1)SP-Cas9-DsRed 的擴增:利用 Primer 5 軟件根據(jù)PX459-Rosa26-SP-DsRed 載體SP 啟動子的上游和DsRed 下游設(shè)計引物，將 Donor 載體MluI 與BstBI 酶切位點對應(yīng)的同源臂分別引入上下游引物，并命名為T-MluI-SP-F 和T-BstBI-R(引物序列見表1)。 以 PX459-Rosa26-SP-DsRed 為模板，PCR 擴增。 反應(yīng)組成:T-MluI-SP-F 1 μL，T-BstBI-R 1 μL，載體 10 ng，2×Vazyme LAmp Master Mix 12.5 μL，補加 ddH2O 至 25 μL。 PCR 反應(yīng)程序:98℃ 2 min(預變性)；98℃ 30 s(變性)，65℃ 30 s(退火)，72℃5 min(延伸)，共 30 個循環(huán)；72℃ 7 min(終延伸)。電泳檢測后對目的條帶進行膠回收。

(2)同源臂載體 Donor 的酶切:利用MluI 和BstBI 對DC-DON-SH02 Rosa26 供體載體進行大量雙酶切，電泳檢測后對大片段進行膠回收。

(3)Donor-Cas9-SP-DsRed 示蹤載體的連接:將得到的SP-Cas9-DsRed 片段與Donor 載體大片段進行同源重組。 反應(yīng)組成:SP-Cas9-DsRed 片段 40 ng，Donor 載體大片段 50 ng，Exnase Ⅱ 1 μL，5 × CEⅡ Buffer 2 μL，補加 ddH2O 至 10 μL。 同源重組條件為37℃ 30 min，立即至于冰上冷卻。 同源重組產(chǎn)物使用感受態(tài)細胞DH5α 進行轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，所得質(zhì)粒經(jīng)MluI 和BstBI 酶切鑒定后測序。

1.2.6 Donor-Cas9-SP-DsRed 示蹤載體在 C2C12 細胞中整合情況的檢測

(1)細胞轉(zhuǎn)染及熒光觀察:按1.2.2 中的條件和方法對C2C12 細胞進行培養(yǎng)以及PX459-Rosa26載體與 Donor-SP-Cas9-DsRed 的共轉(zhuǎn)染。 48 h 后，對熒光表達情況進行觀察。

(2)同源打靶載體整合情況的PCR 鑒定:轉(zhuǎn)染48 h 后加入 Puro 篩選 7 d，提取細胞 DNA。 利用Primer 5 軟件設(shè)計兩對鑒定引物并命名為 5’-Rosa26-F，5’-SP-R 和 3’-Poly(A)-F，3’-Poly(A)-R(引物序列見表1)。 對C2C12 細胞DNA 進行 PCR擴增。 反應(yīng)組成:上下游引物各 1 μL，2×Vazyme LAmp Master Mix 12.5 μL，C2C12 細胞 DNA 10 ng，補加 ddH2O 至 25 μL。 PCR 反應(yīng)程序:98℃ 2 min(預變性)；98℃ 30 s(變性)，62℃ 30 s(退火)，72℃5 min(終延伸)，共 30 個循環(huán)；72℃ 7 min(終延伸)。 電泳檢測后對目的條帶進行膠回收和測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 肌肉特異性表達Cas9 載體PX459-Rosa26-SP的構(gòu)建

PX459-Rosa26 為實驗室前期構(gòu)建的載體，該載體上已連有打靶 Rosa26 位點 sgRNA，因此，選用PX459-Rosa26 作為骨架進行改造(圖2A)。 使用含有限制性內(nèi)切酶KpnI 和AgeI 酶切位點的引物SP-F和SP-R 對PUC57-SP 載體進行SP 啟動子的擴增。電泳結(jié)果顯示，在約300 bp 處觀察到與理論值相符的特異性條帶(圖2B)，即SP 啟動子擴增成功。 用限制性內(nèi)切酶KpnI 和AgeI 分別對SP 啟動子片段和載體PX459-Rosa26 進行酶切，如圖2C 所示，在約800 bp 處出現(xiàn)PX459-Rosa26 載體小片段，回收SP啟動子目的片段及載體大片段并進行連接。 對重組質(zhì)粒進行KpnI 和AgeI 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，在約7800 bp 和300 bp 處出現(xiàn)目的條帶(圖2D)，與理論值相符。 重組質(zhì)粒進行測序鑒定，目的片段未發(fā)生突變，該重組質(zhì)粒命名為PX459-Rosa26-SP。

圖2 PX459-Rosa26-SP 載體的構(gòu)建Note. A. The diagram of PX459-Rosa26-SP construction. B. Results of agarose gel electrophoresis of SP promoter PCR product. M. DL-2000 Marker. 1. Control. 2. PCR product. C. Results of agarose gel electrophoresis of SP promoter enzyme digestion product. M. DL-5000 Marker. 1.Enzyme digestion product. D. Results of agarose gel electrophoresis of PX459-Rosa26-SP enzyme digestion product. M. 250 bp DNA Ladder. 1.Enzyme digestion product.Figure 2 Construction of PX459-Rosa26-SP vector

2.2 肌肉特異性表達Cas9 載體PX459-Rosa26-SP編輯效率的檢測

將 pAcGFP1-N1 載體，PX459-Rosa26 載體，PX459-Rosa26-SP 載體分別轉(zhuǎn)染C2C12 細胞，同時設(shè)置一組未轉(zhuǎn)染載體的C2C12 細胞為陰性對照。 48 h 后，轉(zhuǎn)染了GFP 載體的C2C12 細胞觀察到綠色熒光表達，表明外源質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)染至C2C12 細胞。 轉(zhuǎn)染72 h 后，分別提取轉(zhuǎn)染 PX459-Rosa26 載體，PX459-Rosa26-SP 載體和未轉(zhuǎn)染的3 組細胞的DNA。 使用引物mRosa26-XbaIF1 和mRosa26-XbaI-R1 分別對3 組細胞的DNA 進行擴增。 如圖3A 所示，在約600 bp 處出現(xiàn)目的條帶。PCR 產(chǎn)物進行XbaI 酶切后，理論上會被切為200 bp 與400 bp 兩個片段。 酶切產(chǎn)物進行電泳后，結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染的細胞Rosa26 位點被完全切開，轉(zhuǎn)染PX459-Rosa26 載體和PX459-Rosa26-SP 載體的兩組Rosa26 位點均未被完全切開(圖3B)，這是XbaI 酶切位點發(fā)生突變后使酶切效率降低導致的。 使用T7E1 酶對載體編輯效率進行進一步檢測，電泳結(jié)果顯示(圖3C)，未轉(zhuǎn)染載體的對照組未發(fā)生切割，轉(zhuǎn)染PX459-Rosa26 載體和PX459-Rosa26-SP 載體的酶切不完全。 實驗結(jié)果使用Image Lab 軟件分析。 灰度分析顯示，轉(zhuǎn)染PX459-Rosa26 載體的突變概率為46.42%，轉(zhuǎn)染載體PX459-Rosa26-SP 的突變概率為18.38%。

圖3 PX459-Rosa26-SP 編輯效率檢測Note. A. Results of agarose gel electrophoresis of C2C12 cell DNA PCR products. M. DL-2000 Marker. 1. PCR product of cells transfected with PX459-Rosa26-SP. 2. PCR product of cells transfected with PX459-Rosa26. 3. PCR product of cells without transfected. B. Results of agarose gel electrophoresis of XbaⅠdigestion product. M. DL-2000 Marker 1. Digestion product of cells transfected with PX459-Rosa26-SP. 2. Digestion product of cells without transfected. 3. Digestion product of cells transfected with PX459-Rosa26. C. Results of agarose gel electrophoresis of T7E1 digestion product. M. DL-2000 Marker. 1. Digestion product of cells without transfected. 2. Digestion product of cells transfected withPX459-Rosa26-SP. 3. Digestion product of cells transfected withPX459-Rosa26.Figure 3 Editing efficiency detection of PX459-Rosa26-SP

2.3 肌肉特異性表達 Cas9 示蹤載體 PX459-Rosa26-SP-DsRed 的構(gòu)建及表達活性檢測

PX459-Rosa26-SP-DsRed 載體構(gòu)建過程見圖4A。 以實驗室保存的連有T2A-DsRed 的載體為模板，使用含有限制性內(nèi)切酶EcoRI 酶切位點的引物T2A-DsRed-F 和 T2A-DsRed-R 進行 T2A-DsRed 的擴增。 PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，在約740 bp 左右處觀察到與理論值相符的特異性條帶(圖4B)，即T2A-DsRed 擴增成功。 用限制性內(nèi)切酶EcoRI 對載體 PX459-Rosa26-SP 進行酶切，在800 bp 左右處出現(xiàn)小片段(圖4C)。 回收T2A-DsRed 片段及PX459-Rosa26-SP 載體大片段進行同源重組，對重組質(zhì)粒進行測序鑒定鑒定，目的片段未發(fā)生突變，該重組質(zhì)粒命名為 PX459-Rosa26-SP-DsRed。 將 PX459-Rosa26-SP-DsRed 載體轉(zhuǎn)染至 C2C12 細胞中(圖4D)，轉(zhuǎn)染48 h 后，利用綠光照射C2C12 細胞，可以觀察到紅色熒光(圖4E)，表明SP 啟動子可帶動紅色熒光蛋白基因在成肌細胞中表達。

圖4 PX459-Rosa26-SP-DsRed 構(gòu)建及表達活性分析Note. A. The diagram of PX459-Rosa26-SP-DsRed construction. B. Results of agarose gel electrophoresis of T2A-DsRed PCR product. M. DL-2000 Marker. 1. PCR product. C. Results of agarose gel electrophoresis of PX459-Rosa26-SP digestion product. M. Trans8K DNA Marker Marker.1. Enzyme digestion product. D. C2C12 cells transfected with PX459-Rosa26-SP-DsRed (Brightfield). E. C2C12 cells transfected with PX459-Rosa26-SP-DsRed (Excitation field).Figure 4 Construction and activity analysis of PX459-Rosa26-SP-DsRed

2.4 肌肉特異表達 Cas9 示蹤同源打靶載體Donor-SP-Cas9-DsRed 的構(gòu)建及檢測

Donor-SP-Cas9-DsRed 載體構(gòu)建過程見圖5A。以PX459-Rosa26-SP-DsRed 為模板，擴增 SP-Cas9-DsRed 片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，如圖5B 所示，在約5300 bp 處觀察到與理論值相符的特異性條帶，表明SP-Cas9-DsRed 擴增成功。 用限制性內(nèi)切酶MluI 和BstBI 對Donor 載體進行雙酶切，電泳結(jié)果顯示，在8300 bp 和500 bp 左右處出現(xiàn)兩條條帶，與理論值相符(圖5C)。 回收 SP-Cas9-DsRed 片段及Donor 載體大片段進行同源重組，對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，如圖5D 所示，在約8300 bp 和5400 bp處出現(xiàn)目的條帶，與理論值相符。 測序結(jié)果顯示，目的片段未發(fā)生突變，該重組質(zhì)粒命名為Donor-SPCas9-DsRed。 將 Donor-SP-Cas9-DsRed 載體轉(zhuǎn)染至C2C12 細胞中(圖5E)，同時轉(zhuǎn)染293T 細胞作為對照組。 48 h 后，C2C12 細胞中觀察到紅色熒光與綠色熒光(圖5F，5G)，而對照組的293T 細胞只觀察到綠色熒光的表達(圖略)，表明所構(gòu)建的Donor-SP-Cas9-DsRed 載體能在細胞中正常表達且具有細胞特異性。

圖5 Donor-SP-Cas9-DsRed 構(gòu)建及表達活性分析Note. A. The diagram of Donor-SP-Cas9-DsRed construction. B. Results of agarose gel electrophoresis of SP-Cas9-DsRed PCR product. M.Trans8K DNA Marker. 1. PCR product.C. Results of agarose gel electrophoresis of Donor digestion product. M. Trans8K DNA Marker. 1. Enzyme digestion product. D. Results of agarose gel electrophoresis of Donor-SP-Cas9-DsRed enzyme digestion product. M. 250 bp DNA Ladder. 1. Enzyme digestion product. E. C2C12 cells transfected with Donor-SP-Cas9-DsRed (Brightfield). F. C2C12 cells transfected with Donor-SP-Cas9-DsRed(C2C12 cell expressed GFP). G. C2C12 cells transfected with Donor-SP-Cas9-DsRed (C2C12 cell expressed DsRed).Figure 5 Construction and activity analysis of Donor-SP-Cas9-DsRed

2.5 肌肉特異表達 Cas9 示蹤同源打靶載體Donor-SP-Cas9-DsRed 在C2C12 細胞中整合

將PX459-Rosa26 載體和Donor-SP-Cas9-DsRed載體共轉(zhuǎn)染至 C2C12 細胞中(圖 6A)，48 h 后，C2C12 細胞表達綠色熒光和紅色熒光(圖6B，6C)。對轉(zhuǎn)染后的細胞進行終濃度為1.1 μg/μL 的Puro篩選。 7 d 后，細胞表達綠色熒光和紅色熒光，提取細胞 DNA 進行 PCR 鑒定。 圖 6D 為 3’ 端插入情況，在約1200 bp 處出現(xiàn)特異性條帶，與理論值相符。 圖 6E 為5’端插入情況，在約 1000 bp 處出現(xiàn)與理論值相符的特異性條帶，PCR 產(chǎn)物回收后進行測序，測序結(jié)果與理論序列相符，表明構(gòu)建的Donor-SP-Cas9-DsRed 載體整合到 C2C12 細胞 Rosa26位點。

圖6 Donor-SP-Cas9-DsRed 整合檢測Note. A. C2C12 cells after co-transfection (Brightfield). B. C2C12 cells after co-transfection (C2C12 cell expressed GFP). C. C2C12 cells after co-transfection (C2C12 cell expressed DsRed). D. Results of agarose gel electrophoresis of 3’DNA PCR product. M. DL-2000 Marker. 1. PCR product. E. Results of agarose gel electrophoresis of 5’DNA PCR product. M. DL-2000 Marker. 1. PCR product.Figure 6 Cell intergation detection of Donor-SP-Cas9-DsRed

3 討論

與“鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)”和“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)”技術(shù)相比[15-16]，第三代“基因組定點編輯技術(shù)”CRISPR/Cas9，具有成本低、制作便捷以及快捷高效等優(yōu)點，并已成為科學研究領(lǐng)域的有效工具[17-18]。Rosa26 位點位于小鼠六號染色體上，被應(yīng)用于整合轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體以在小鼠中實現(xiàn)普遍存在或條件基因表達[19]。Rosa26 由3 個外顯子構(gòu)成，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為一種非必需、非編碼的RNA，并且不會翻譯成蛋白質(zhì)[20]。 因此，Rosa26 位點也有“安全港”之稱。 經(jīng)研究證實，Rosa26 基因在大部分組織和細胞中都有表達，因此，在此區(qū)域定點插入外源DNA，在各組織中表達的可能性都會非常高[21]。Rosa26 位點基因編輯技術(shù)可以非常有效地建立多用途的條件性轉(zhuǎn)基因動物模型，因此，本研究選取Rosa26 位點作為打靶位點進行研究。

對特定組織進行基因改造時，需要保證個體其它組織器官正常的生長發(fā)育不受影響。 為實現(xiàn)肌肉特異打靶的同時不損害其它組織器官的生理功能，本研究選用肌肉特異啟動子SP 驅(qū)動Cas9 的表達，并以打靶小鼠Rosa26 位點的Cas9 載體PX459-Rosa26 為骨架，構(gòu)建肌肉特異表達 Cas9 載體PX459-Rosa26-SP。 C2C12 細胞作為骨骼肌前體細胞，是研究成肌細胞增殖分化的理想模型[22]。 隨后，我們對成肌細胞C2C12 進行轉(zhuǎn)染和基因組編輯效率的檢測。 轉(zhuǎn)染PX459-Rosa26-SP 后，提取細胞基因組并進行酶切驗證，突變的概率為18.38%，表明SP 啟動子可帶動Cas9 蛋白在C2C12 細胞中表達。 之后，我們在載體Cas9 后引入DsRed 紅色熒光報告基因，可通過熒光的表達來直觀的觀察SP 啟動子在不同細胞中的特異表達情況。 在去除Rosa26 位點 Donor 載體 ORF 區(qū)的 CMV 啟動子后，我們在該載體骨架上連接SP-Cas9-DsRed，構(gòu)建肌肉特異表達Cas9 示蹤同源打靶載體Donor-SP-Cas9-DsRed。 將 Donor-SP-Cas9-DsRed 和 PX459-Rosa26共轉(zhuǎn)至C2C12 細胞后，細胞可表達綠色熒光和紅色熒光，且這種現(xiàn)象是肌肉細胞特異性的，即SP 啟動子可啟動外源基因的肌肉特異性表達。 對轉(zhuǎn)染后的C2C12 細胞進行Puro 篩選后得到陽性細胞進行基因組的提取和 PCR 鑒定，該載體成功整合到C2C12 細胞Rosa26 位點。 我們構(gòu)建的系統(tǒng)可用于肌肉特異表達Cas9 小鼠模型的制備和肌肉特異性基因編輯的研究。