梁娟　魏海英　于盟盟　張倩玉　牟丹丹　趙濤濤

摘要：為建立水產(chǎn)苗種中己烯雌酚（Diethylstibestrol，DES）殘留量的定性、定量檢測的酶聯(lián)免疫（ELISA）法，采用乙酸乙酯作為提取劑，超聲振蕩提取替代渦旋振蕩提取、純水對正己烷進(jìn)行飽和等措施對前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)考察了基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。DES在0.150～9.00 ng·mL的加標(biāo)水平范圍內(nèi)，曲線相關(guān)系數(shù)R=0.997，方法定量限為0.075 μg·kg;中國對蝦苗種、三疣梭子蟹苗種、刺參苗種、牙鲆苗種在0.075、0.150、0.750 μg·kg加標(biāo)水平下，平均回收率測定范圍為74.3%～96.7%，精密度范圍為3.7%～7.6%。試驗(yàn)結(jié)果表明，該法靈敏度更高、特異性強(qiáng)、快速簡便，適用于不同基質(zhì)水產(chǎn)苗種中DES殘留量的定性和定量分析。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)苗種;己烯雌酚;殘留量;不同基質(zhì);酶聯(lián)免疫法

己烯雌酚（DES）是一種人工合成的雌激素，具有調(diào)節(jié)生物機(jī)體代謝、生長、發(fā)育及生殖等作用，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成代謝，導(dǎo)致氨基酸合成蛋白質(zhì)的速度加快而使體重增加[1]，曾被水產(chǎn)育苗和養(yǎng)殖技術(shù)人員作為提高產(chǎn)量的“法寶”，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，在醫(yī)學(xué)上也被廣泛應(yīng)用于婦科病的預(yù)防和治療[2]。DES在生態(tài)環(huán)境中降解緩慢，通過食物鏈進(jìn)入人體，會誘發(fā)少兒發(fā)育早熟、生殖器病變，引起后代多種泌尿生殖系統(tǒng)異常[3]，甚至對人體產(chǎn)生致畸、致癌、致突變等危害[4]，即使排出體外也會在土壤和水源中富集，造成生態(tài)環(huán)境污染惡性循環(huán)。許多國家已明令禁止將DES用于動物養(yǎng)殖。早在1971年，美國就已頒布禁止使用DES的相關(guān)法令，隨后1978年歐盟也頒發(fā)相關(guān)禁止法令，2012年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將DES列為Ⅰ類人類致癌物[5];2002年《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第193號》明確將DES及代謝物列為食品動物中禁用的獸藥，2020年《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號》也明確規(guī)定，DES及其鹽和酯在所有動物源性食品中不得檢出。但由于缺乏科學(xué)管理和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，DES的違規(guī)使用現(xiàn)象屢禁不止。

在水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督工作中，大型儀器分析方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，常作為藥物殘留檢測的確認(rèn)方法。然而，水產(chǎn)苗種的繁育季節(jié)性強(qiáng)、周期短，抽檢樣品用大型精密儀器進(jìn)行檢測，由于檢測技術(shù)復(fù)雜、前處理過程耗時(shí)長、檢測結(jié)果滯后等原因，陽性樣品檢測結(jié)果上報(bào)給漁業(yè)主管部門時(shí)，苗種已被銷售，不但貽誤最佳執(zhí)法時(shí)機(jī)，而且容易使陽性苗種流向養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，從源頭上造成水產(chǎn)品質(zhì)量安全的隱患。因此，在水產(chǎn)苗種的實(shí)際檢測工作中，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡便、健康安全的方法，為漁業(yè)質(zhì)量安全主管部門的管理工作提供及時(shí)的技術(shù)支撐，提高執(zhí)法工作的實(shí)效性具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前DES的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[7]、高效液相色譜法（HPLC）[8-9]、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）[10]、高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[11]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）[12]、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（LC-HRMS）[13]等大型精密儀器分析法，ELISA法測定水產(chǎn)品及動物性食品中DES殘留量也有SC/T 3020-2004《水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的測定 酶聯(lián)免疫法》[14]和農(nóng)業(yè)部1163號公告-1-2009《動物性食品中己烯雌酚殘留檢測酶聯(lián)免疫吸附測定》[15]等相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。近幾年來，DES的分析檢測方法在不斷地完善，進(jìn)一步優(yōu)化預(yù)處理技術(shù)，提高儀器靈敏度，建立更高效、更安全、更環(huán)保和更便捷的ELISA檢測方法是發(fā)展的趨勢[16]，也是食品安全檢測領(lǐng)域中最具有發(fā)展前景和產(chǎn)業(yè)化的檢測技術(shù)[17]。本文對美國柏爾生物技術(shù)公司提供的試劑盒使用方法采用超聲振蕩提取替代渦旋振蕩提取、純水對正己烷進(jìn)行飽和等優(yōu)化改進(jìn)措施，以期建立對不同基質(zhì)水產(chǎn)苗種中DES殘留量進(jìn)行定性、定量測定的ELISA分析方法，為漁業(yè)質(zhì)量安全主管部門的監(jiān)管工作提供及時(shí)、準(zhǔn)確的技術(shù)保障。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

MK3微孔板酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];微量移液器、多道微量移液器（賽默飛世爾科技有限公司）;PL202-L電子精密天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）;KQ-5200DE超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;DC-24水浴氮吹儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）;10D經(jīng)濟(jì)型純水儀（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）;DNP-9002BS-III電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;96孔DES檢測試劑盒（美國柏爾生物技術(shù)公司）;乙酸乙酯、無水CaCl2、甲醇（AR，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;正己烷（AR，天津科密歐試劑有限公司）。

1.2樣品

中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等苗種樣品分別由國家北方蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照站、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)刺參產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照綜合試驗(yàn)站和山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照東港綜合試驗(yàn)站提供。

1.3方法

1.3.1試劑配制

1.3.1.1HRP-Conjugated Antibody 2#溶液配制取100 μl 100×HRP酶標(biāo)二抗（HRP-Conjugated Antibody 2）加入到9.9 mL二抗稀釋液（Antibody Diluent2 ）中，按1∶99比例將100×HRP-Conjugated Antibody 2稀釋為10 mL的1×HRP-Conjugated Antibody 2。

1.3.1.2Wash Solution洗液配制取10 mL的20×濃縮洗液（Wash Solution）加入到190? mL純水中，按1∶19比例配制1×Wash Solution。

1.3.1.3PBS溶液配制取1 mL的10×緩沖液（PBS）加入到9 mL雙蒸餾水中，按1∶19比例配制成10 mL的1×PBS。

1.3.1.4PBS-甲醇溶液配制取3 mL的1×PBS加入2 mL甲醇，按3∶2比例配制1×PBS-甲醇溶液。

1.3.2樣品處理挑出樣品中餌料等雜質(zhì)，用去離子水清洗、瀝干，攪碎成糜狀，充分混合均勻;準(zhǔn)確稱取樣品（3.00±0.01）g置于25 mL聚丙烯離心管中，加入9 mL乙酸乙酯和0.3 g CaCl2，超聲振蕩20 min，（22.5±2.5）℃ 4 000 r/min離心5 min;移取6 mL上清液，置于10 mL聚丙烯離心管中，（50～60）℃水浴氮?dú)獯蹈?加入2.00 mL飽和正己烷溶解殘留物，再加入1.00 mL的1×PBS/甲醇，超聲振蕩15 min;（22.5±2.5）℃ 4 000 r/min離心10 min，棄去上層飽和正己烷層，下層溶液供酶標(biāo)板進(jìn)行檢測。

1.3.3孵育過程移取標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品上機(jī)液50 μL，置于對應(yīng)的孔中;再依次加入100 μL DES一抗（Diethylstilbestrol Antibody 1#），輕敲微孔板邊緣混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，（22.5±2.5）℃避光孵育30 min;小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔及時(shí)加入洗滌液250 μL，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，將孔內(nèi)液體甩干，重復(fù)洗板步驟3次，每次間隔10 s，最后一次洗板后，應(yīng)使板盡量甩干并在吸水紙上倒扣、排干（排干后若有氣泡，先用洗耳球吹破，再拍干）;再按以上順序?qū)⒚棵笜?biāo)板孔加入150 μL的1×HRP-Conjugated Antibody 2#，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，（22.5±2.5）℃避光孵育30 min;按照上述洗板方法再次洗板;每酶標(biāo)板孔加入100 μL的底物（TMB Substrate），輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，（22.5±2.5）℃避光孵育15～20 min;每酶標(biāo)板孔加入100 μL的終止液（Stop Buffer）終止顯色反應(yīng)，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，穩(wěn)定1 min后，上機(jī)測定（上機(jī)前30～40 min打開酶標(biāo)儀，使儀器狀態(tài)穩(wěn)定，并將測試波長設(shè)定為450 nm）。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的選擇

DES為一類脂溶性化合物，易在動物的脂肪及組織中殘留[3]。在前處理過程中，根據(jù)樣品的不同性質(zhì)，一般用叔丁基甲基醚、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑對待測組分進(jìn)行提取。近年來，已有研究表明叔丁基甲基醚能引起頭痛、頭暈、惡心等癥狀，具有致突變性及致癌作用[18]，美國 EPA 已將其列入致癌物質(zhì)名單中[19];乙腈、甲醇、乙醇與水的互溶性較強(qiáng)，會將水產(chǎn)品中部分水溶性蛋白提取出來，帶來更多雜質(zhì)，使提取液渾濁，不利于后續(xù)凈化[20];乙酸乙酯極性與DES極性相近，用乙酸乙酯提取的樣品回收率趨于穩(wěn)定狀態(tài)，為凈化工序提供有力保障，回收率高，效果理想，是DES最佳提取溶液[21-22]。因此，本方法選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2振蕩提取的選擇

徐英江等[16]研究發(fā)現(xiàn)，對動物源性樣品中DES提取，采用超聲振蕩提取可以使溶劑快速地進(jìn)入到固體物質(zhì)中或與液體物質(zhì)盡快混合，具有縮短提取時(shí)間，有效提高萃取率，節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn);陳溪等[23]對化妝品中DES等7種雌激素采用超聲振蕩提取，經(jīng)凝膠滲透凈化色譜（GPC）凈化，回收率為69.4%～108.7%;劉美華等[24]用離子液體和分散劑對廢水樣品中DES等組分進(jìn)行超聲輔助萃取，提高了回收率。綜上所述，采用超聲振蕩的方式對目標(biāo)組分進(jìn)行提取已成為一種常態(tài)。故本方法將渦旋振蕩提取優(yōu)化為超聲振蕩提取。但是，超聲提取時(shí)間過短容易混合不勻，提取不充分，造成假陰性;超聲提取時(shí)間過長會溶解出更多的雜質(zhì)成分造成乳化現(xiàn)象，把握好超聲振蕩時(shí)間是操作的關(guān)鍵。

選取中國對蝦苗種、三疣梭子蟹苗種、刺參苗種、牙鲆苗種4種不同基質(zhì)的DES陰性樣品，每種基質(zhì)樣品稱取12份，均添加為1.00 μg·kg加標(biāo)水平，每2份為一組，設(shè)6個(gè)平行組。固定超聲頻率為40 kHz，分別超聲振蕩5、10、15、20、25、30 min，以考察超聲振蕩時(shí)間對DES檢出水平和提取液乳化現(xiàn)象的影響（表1）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲時(shí)間在5～25 min范圍內(nèi)，樣品提取液狀態(tài)良好，未出現(xiàn)混濁和乳化現(xiàn)象，超聲超過25 min時(shí)，樣品提取液開始出現(xiàn)混濁和乳化現(xiàn)象;樣品平均檢出水平在5～20 min范圍內(nèi)隨著時(shí)間的延長而提高，在20 min時(shí)達(dá)到最大值，在20～25 min范圍內(nèi)基本不變，超聲時(shí)間為30 min時(shí)，平均檢出水平明顯降低，這可能是多次用正己烷去乳化層導(dǎo)致DES損失所致。由此可見，超聲振蕩適用于DES的提取，且最佳超聲提取時(shí)間為20 min。

2.3加標(biāo)回收率與精密度（RSD）

GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[25]規(guī)定，對食品中禁用藥物，回收率應(yīng)在方法檢測下限、兩倍方法檢測下限和十倍方法檢測下限進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。同大型儀器分析法的自動進(jìn)樣方式不同，ELISA法是手動進(jìn)樣，如何正確操作微量移液器是減少偶然誤差、增加微量進(jìn)樣穩(wěn)定性、確保精密度、提高加標(biāo)回收率的關(guān)鍵，梁娟等[26]認(rèn)為“吸二打一”的操作手法是有效解決這一問題的關(guān)鍵。本文選取4種不同基質(zhì)的DES陰性樣品，分別作0.075、0.150和0.750 μg·kg三個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行檢測，每個(gè)加標(biāo)水平設(shè)6組重復(fù)，計(jì)算平均回收率和RSD。三個(gè)加標(biāo)水平回收率均在74.3%～96.7%之間，RSD測定范圍為3.7%～7.6%（表2）。由此可見，本文所建立的方法具有良好的準(zhǔn)確度和RSD，可以對樣品中DES殘留量進(jìn)行定性、定量測定。

2.4線性范圍及定量限

針對魚、蝦等水產(chǎn)品中可食部分，美國柏爾生物技術(shù)公司試劑盒定量檢測下限為0.075 0 μg·kg，本試驗(yàn)通過對前處理過程進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等四種不同基質(zhì)苗種在0.075 0 μg·kg加標(biāo)水平下，加標(biāo)回收率和精密度均達(dá)到GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[25]的質(zhì)量控制規(guī)定（表3）。與《農(nóng)業(yè)部1163號公告-9-2009 水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留檢測 氣相色譜-質(zhì)譜法》[27]中規(guī)定的GC-MS法相比，ELISA法定量限較低、靈敏度較高（表3），DES在0.150～9.00 ng·mL的水平范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好R2=0.997。

2.5基質(zhì)效應(yīng)的考察

不同種類的樣品之間性質(zhì)差異很大，會產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應(yīng)，樣品基質(zhì)對反應(yīng)的干擾是影響ELISA法檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的一個(gè)重要因素。樣品或樣品提取液中的化學(xué)物質(zhì)，如雜蛋白、脂肪、色素等，可能會影響抗體與DES的結(jié)合，降低方法靈敏度和穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致假陽性[28]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部1192號公告-1-2009《水產(chǎn)苗種違禁藥物抽檢技術(shù)規(guī)范》[29]中規(guī)定，苗種樣品的制備不應(yīng)只取可食部分，而是整條/只攪碎混合均勻?？赡苁切窔ぁⅣ~骨、蝦殼等雜質(zhì)的影響，造成樣品空白的檢出水平偏高，導(dǎo)致中國對蝦、三疣梭子蟹、牙鲆等苗種的基質(zhì)效應(yīng)比較明顯，加標(biāo)回收率相對刺參苗種較低，但四種不同基質(zhì)樣品的三個(gè)加標(biāo)水平回收率均在74.3%～96.7%之間，精密度測定范圍為3.7%～7.6%（表3），符合水產(chǎn)品質(zhì)量安全主管部門的規(guī)定。由此可見，本方法適用于不同基質(zhì)水產(chǎn)苗種中DES的測定。

2.6正己烷的優(yōu)化結(jié)果

DES具有很強(qiáng)的親脂性，水產(chǎn)苗種樣品基質(zhì)復(fù)雜、脂肪含量高，提取液極易產(chǎn)生渾濁或乳化現(xiàn)象，不利于DES的提取和凈化，容易在測定過程中產(chǎn)生ME，因此有必要在前處理過程中用正己烷對樣品提取液進(jìn)行凈化，以將溶液中的雜質(zhì)、脂肪去除。當(dāng)乳化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，乳化層不能一次去除時(shí)，需要增加正己烷去脂的次數(shù)。但是，用正己烷去脂凈化的同時(shí)會導(dǎo)致樣品提取液損失一部分DES，使得目標(biāo)組分檢出水平降低，容易導(dǎo)致樣品的假陰性。將正己烷用純水進(jìn)行飽和，可以減少DES的損失，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本文用DES陰性樣品作1.00 μg·kg加標(biāo)水平，分別用正己烷試劑和飽和正己烷進(jìn)行去脂，每種去脂方式設(shè)3組重復(fù)，分別計(jì)算平均檢出水平。結(jié)果顯示，用飽和正己烷去脂的樣品檢出濃度較高（表4），由此可見用純水對正己烷試劑進(jìn)行飽和的必要性。

2.7溫度對測定值的影響

ELISA法測定溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在（22.5±2.5）℃，溫度過高或過低，都不利于抗原抗體有效結(jié)合，降低靈敏度和方法穩(wěn)定性。當(dāng)0濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的吸光度值（B0）低于0.6時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)[28，30]。但是，不同批次的試劑盒可能顯示不同的B0值，相對吸光度值具有很好的穩(wěn)定性。梁康建等[28]通過試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)得知，50%抑制DES濃度的吸光度值（B）與0濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的吸光度比值高于0.7（即B/B0>0.7）時(shí)，即可判定ELISA試劑盒已失效。試劑盒應(yīng)在2～8 ℃溫度下儲存，在37 ℃溫度下放置1 d，相當(dāng)于在4 ℃溫度下放置45 d，使試劑盒保質(zhì)期縮短。

3結(jié)論與討論

ELISA法的缺點(diǎn)是影響因素較多，易出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果，抗體批次不同，測定結(jié)果也會出現(xiàn)差異。但大型儀器分析方法對儀器設(shè)備要求較高，樣品前處理過程復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)大量樣品現(xiàn)場快速檢測。與大型儀器分析方法相比，ELISA法具備靈敏快捷、精密度高、分析成本低、操作步驟簡單、有機(jī)試劑使用量少、對人體傷害和環(huán)境污染危險(xiǎn)性小等優(yōu)勢。通過多年實(shí)際檢測結(jié)果得知，用本方法檢出的陽性樣品，后續(xù)又用GC-MS法對其結(jié)果進(jìn)行確證，檢測結(jié)果一致。由此可見，本方法可用于實(shí)際樣品檢測，能夠較好地滿足水產(chǎn)苗種質(zhì)量安全監(jiān)管部門的需要，是目前水產(chǎn)苗種質(zhì)量安全檢測工作中值得推廣的方法。參考文獻(xiàn)：

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for diethylstilbestrol in aquatic seedlings with different substrates

LIANG Juan WEI Haiying，YU Mengmeng，Zhang Qianyu，MU Dandan，ZHAO Taotao

（Rizhao Marine and Fishery Research Institute，Rizhao 276826，China）

Abstract：In order to establish an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method for the qualitative and quantitative detection of diethylstilbestrol （DES） residues in aquatic seedlings，the pretreatment process was optimized by using ethyl acetate as extractant，ultrasonic oscillation extraction instead of vortex oscillation extraction，and n-hexane saturation with pure water.At the same time，the influence of matrix effect on the detection results was investigated.Diethylstilbestrol had good linear in the range of 0.150～9.00 ng·mL-1，with the correlation coefficients R2=0.997，and the detection limit was 0.075 μg·kg-1; The average recoveries ranged from 74.3%～96.7% at the spiked level of 0075，0.150 and 0.750 μg·kg-1 in the seedlings of Penaeus chinensis，Portunus trituberculatus，Stichopus japonicus and Paralichthys olivaceus.The relative standard deviations was 3.7%～7.6%.The results showed that this method was accurate，rapid and cheap，which would be suitable for qualitative and quantitative analysis of diethylstilbestrol residues in aquatic seedlings with different substrates.

Key words：aquatic seedlings; diethylstilbestrol; residue; different substrates; ELISA