薛寶玲，宋曉彬

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術(shù)學院食品工程技術(shù)系，內(nèi)蒙古包頭 014109；2. 內(nèi)蒙古烏蘭察布市食品藥品檢驗所，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

玉米作為一種重要的食品來源，也是全球第一大谷物[1]，營養(yǎng)豐富，堪稱“五谷之首”，全世界約有30%以上的人選擇玉米作為主食[2]。葉酸又稱維M、維B9，葉酸是維B 復合體之一，有促進骨髓中幼細胞成熟的作用，可改善血管內(nèi)皮功能、預防心血管疾病[3-4]。葉酸在玉米中含量較高，適用于葉酸缺乏人群有效補充葉酸。

目前，天然植物中葉酸檢測的方法主要有微生物法和高效液相色譜法。高效液相色譜法的特點是測定結(jié)果準確、 操作簡便、省時省力、分析速度快、分離效果好[5]，是近年來發(fā)展速度較快的測定葉酸的方法。目前，世界范圍內(nèi)利用高效液相色譜法來測定葉酸的產(chǎn)品范圍比較廣泛。而國內(nèi)將其運用于檢測血漿、保健食品等中葉酸比較多，用于果蔬中葉酸檢測的報道甚少[6-8]。由于質(zhì)譜儀高靈敏度的特性使其能夠檢測含量很低的樣品，并在定性和定量分析方面表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢[9]，所以可以通過液質(zhì)聯(lián)用來測定葉酸。主要研究玉米在不同加工過程中葉酸穩(wěn)定性的變化規(guī)律，為加工中營養(yǎng)成分的保持提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的冷凍玉米，進行短暫的常溫解凍，100 ℃沸水下煮制，待玉米籽粒有香氣揮發(fā)時將玉米籽粒取出，液氮凍干機將玉米籽粒凍干，將干燥的玉米籽粒研磨成粉末，完全避光保存，待用。玉米籽粒真空包裝進行加工，加工后放入-80 ℃下保存，冷卻后拆開封口袋，按加工方式及對應的梯度分批次放入凍干機中研磨，避光干燥保存待用。

α - 淀粉酶，上海冠導生物工程有限公司提供；β - 巰基乙醇，山東三方化工集團提供；Na2HPO4·2H2O，NaH2PO4·2H2O，青島永潤化工科技有限公司提供；蛋白酶，上海翔陵化工有限公司提供；抗壞血酸鈉鹽，西安晉恒化工有限公司提供；甲醇、乙腈，天津市曾輝科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

ACCULAB ALC 型分析天平，梅特勒- 托利多儀器有限公司產(chǎn)品；pB-10 型pH 計，季爾國際貿(mào)易（上海） 有限公司產(chǎn)品；H2500R-2 型高速冷凍離心機，湘銳離心機儀器有限公司產(chǎn)品；水浴鍋，西安科創(chuàng)實驗室有限公司產(chǎn)品；DZF-603-A 型真空干燥箱，中國濟南天宇專用設備有限公司產(chǎn)品；ZXZ-2 型真空泵，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；BC/BD-608 型冷柜，金壇訊生儀器有限公司產(chǎn)品；DTH40 型玉米膨化機，上海印溪儀器儀表有限公司產(chǎn)品；KQ-600DE 型超聲波清洗器，上海光譜儀器廠產(chǎn)品；高效液相色譜儀，北京安捷倫有限公司產(chǎn)品；Arium 61316 型超純水器，賽多利斯儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 新鮮玉米粒提取

取新鮮的冷凍玉米，常溫下解凍，在100 ℃沸水中煮制3~5 min，待玉米籽粒有香氣揮發(fā)時將玉米籽粒取出，使用液氮凍干機將玉米籽粒凍干約24 h 左右，使用研磨儀磨成所需的玉米樣品粉末（防止玉米樣品在稱取過程中受潮，造成試驗誤差），在干燥環(huán)境下分別稱取5 份250 mg 玉米粉末樣品，置于離心管封裝、標記樣品名稱，完全避光保存待用。

分別取3 份20 g 玉米籽粒真空包裝，封口后分別進行蒸制、煮制（不去掉真空包裝袋）、微波的加工處理。加工過程中每種加工方式取5 份250 μg 玉米籽粒樣品置于離心管中，分別進行的3 種加工方式，以加工時間為變量，蒸制使用蒸鍋蒸1，2，3，4，5 min，水量為1.5 L，煮制使用電磁爐煮40 s，1 min，2 min，3 min，4 min 水量為1 L，微波加工使用微波爐微波10，20，40，50，60 s。加工后放入冰箱在-80 ℃下保存，凍干研磨離心，標記加工方式和時間梯度，避光干燥保存，待用。

1.3.2 玉米葉酸提取條件優(yōu)化

在進行不同加工方法下葉酸含量變化探究試驗之前，所需單因素條件不明確，需對提取過程中不同的單因素進行葉酸含量測定。在試驗過程中，所有的樣品都為非即時測定，需在-80 ℃下避光保存一段時間再進行測定。得出最優(yōu)的各項單因素，從而可以優(yōu)化測定條件，使不同加工方式下對即食玉米棒中葉酸含量的變化規(guī)律更加明顯易得，同時降低試驗誤差，精確最后需要的試驗數(shù)據(jù)。

單因素試驗指標及用量見表1。

表1 單因素試驗指標及用量

（1） 試驗試劑。α - 淀粉酶溶液40 mg/mL，水溶；蛋白酶溶液2 mg/mL，水溶；試驗用水，均為超純水；每100 mL 提取液；β - 巰基乙醇200 μL；0.1 mol/L Na2HPO4·2H2O；0.1 mol/L NaH2PO4·2H2O；1×1=1 g 抗壞血酸鈉鹽；甲醇；乙腈。

（2） 試驗方案。提取液：先配置0.1 mol/L 磷酸二氫鈉，0.1 mol/L 磷酸氫二鈉，若預配置100 mL 提取液，則先在燒杯中添加設定的抗壞血酸鈉，再添加磷酸氫二鈉適量，最后添加磷酸二氫鈉，pH 計測定設定的pH 值，上述步驟完成，添加0.5 mL 的β -巰基乙醇，之后按如下步驟操作。

①取250 mg 玉米籽粒凍干粉于離心管中，加入5 000 μL 提取液渦旋振蕩器振蕩，使凍干粉與溶液充分混勻，100 ℃下加熱10 min。②冰上迅速冷卻，加入設定的α - 淀粉酶溶液，置于渦旋振蕩器中振蕩，使 α - 淀粉酶溶液與提取液充分混合，再置于金屬浴加熱振蕩器上振蕩30 min（37 ℃）。③加入設定的蛋白酶溶液，置于渦旋振蕩器中振蕩，使蛋白酶溶液與提取液充分混合，再置于金屬浴加熱振蕩器上振蕩60 min（37 ℃）。④取上清，加入設定的大鼠血清，金屬浴加熱振蕩器振蕩4 h 然后100 ℃加熱10 min，冰上冷卻10 min，離心處理（轉(zhuǎn)速9 000 r/min，時間10 min）。⑤取上層清液，用0.22 μm 有機濾膜過濾，將濾液裝入液相小瓶。

（3） 檢測色譜。根據(jù)相關(guān)資料，檢測色譜條件如下：①經(jīng)HPLC 分析。測定標品在13.205 min 時出所需峰面積，所以大致在13 min 左右，將會得到試驗所需的樣品峰。②色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A 為乙腈，B 為0.1 mol/L NaH2PO4溶液（0~5 min，5%；5~20 min，梯度上升到20%；20~30 min 保持30~40 min，5%乙腈；pH 值7.0）；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量20 μL；柱溫35 ℃。③HPLC 流動相。試驗所需流動相為A：乙腈溶液500 mL，B：0.1 mol/L NaH2PO4溶液1 L。其中，0.1 mol/L NaH2PO4溶液需要在配制完成后進行超聲去氣泡溶解，抽濾裝置上進行過膜凈化，防止堵塞色譜柱；所有流動相溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

（4） 葉酸含量計算。根據(jù)高效液相色譜法測定葉酸，根據(jù)標準品的葉酸含量和峰面積計算樣品葉酸含量的公式。所測定標準品的峰面積和質(zhì)量濃度分別為328.4，100 μg/mL，峰面積與質(zhì)量濃度呈正比，所以得到公式：

高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 即食玉米棒葉酸提取單因素條件優(yōu)化結(jié)果及分析

通過對即食玉米棒中測定葉酸的6 項單因素試驗，根據(jù)每項單因素的用量和HPLC 測定含量結(jié)果進行單因素試驗分析。

2.1.1 α - 淀粉酶對玉米棒中葉酸得率的影響

玉米含有大量的淀粉，α - 淀粉酶在提取液中的作用為酶解樣品中多余的淀粉，減少試驗誤差。在提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化α - 淀粉酶用量。

α - 淀粉酶用量對提取玉米葉酸得率的影響見圖2。

圖2 α - 淀粉酶用量對提取玉米葉酸得率的影響

由圖2 可知，在60，80，100，140，180 μL 的α - 淀粉酶用量5 個水平下，隨著用量的增加，葉酸含量先增加再降低，在添加100 μL 時，葉酸含量達到最大值，隨后葉酸含量開始下降，卻定α - 淀粉酶的最佳用量為100 μL，即添加100 μL 質(zhì)量濃度為40 mg/mL的α - 淀粉酶，表明該質(zhì)量濃度下玉米籽粒粉末樣品中的淀粉對葉酸含量測定的干擾最低。

2.1.2 蛋白酶對玉米棒中葉酸得率的影響

添加蛋白酶在提取液中可以酶解植物蛋白，保留葉酸。在提取溫度為37 ℃，其他單因素及相同加工條件（煮制） 不變，變化蛋白酶用量。

蛋白酶用量對提取玉米葉酸得率的影響見圖3。

圖3 蛋白酶用量對提取玉米葉酸得率的影響

由圖3 可知，在0，10，20，30，40 μL 用量5 個水平下，隨著蛋白酶用量的增加，葉酸得率先增加再降低再增加，在添加質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的蛋白酶20 μL 后，葉酸含量開始下降。確認20 μL 蛋白酶為最佳用量，在該用量下，樣品中的蛋白對葉酸含量的干擾最低。

2.1.3 大鼠血清對玉米棒中葉酸得率的影響

大鼠血清在提取過程中起到酶解（軛合酶） 的作用。試驗在提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化大鼠血清用量。

大鼠血清用量對提取玉米葉酸得率的影響見圖4。

圖4 大鼠血清用量對提取玉米葉酸得率的影響

由圖4 可知，在0，35，70，150，200 μL 用量5 個水平下，隨著用量的增加，葉酸含量先增加再降低，在添加大鼠血清70 μL 后，葉酸含量開始下降，提取過程中添加大鼠血清70 μL 為最佳用量，此時大鼠血清在提取液中的酶解效果最好。

2.1.4 β - 巰基乙醇對玉米棒中葉酸得率的影響

由于葉酸對光和熱不穩(wěn)定，而在提取過程中樣品及提取液有時會處于不完全避光和熱不穩(wěn)定的物理條件下，β - 巰基乙醇在提取過程中的作用是為了保護葉酸穩(wěn)定性，防止葉酸降解及流失。對即食玉米棒提取葉酸時，提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化β -巰基乙醇用量。

β- 巰基乙醇對提取玉米葉酸得率的影響見圖5。

圖5 β - 巰基乙醇對提取玉米葉酸得率的影響

由圖5 可知，在100，300，500，700，1 000 μL用量5 個水平下，隨著β - 巰基乙醇用量的增加，葉酸含量先增加再降低，在添加500 μL 后，葉酸含量開始下降。因此，β - 巰基乙醇在提取過程中500 μL為最佳用量，此時β - 巰基乙醇對葉酸的保護效果最好。

2.1.5 pH 值對玉米棒中葉酸得率的影響

在提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化pH 值即提取液的酸堿環(huán)境。

pH 值對提取玉米葉酸得率的影響見圖6。

圖6 pH 值對提取玉米葉酸得率的影響

由圖6 可知，在提取液pH 值為5.0，6.5，7.0，7.5，8.0 這5 個水平下，隨著pH 值的增加，葉酸得率先增加再降低，弱堿性下（pH 值＞7.0） 葉酸得率較高；當pH 值為7.5 時，葉酸含量開始下降，所以葉酸在提取過程中的提取環(huán)境酸堿度pH 值7.5 時為最佳提取液酸堿度，葉酸在弱堿性環(huán)境下的HPLC提取含量最高。當流動相的有機相比例和pH 值偏酸性時，葉酸的保留時間越長，得到的色譜峰形較差，而且低pH 值也會影響葉酸的穩(wěn)定性。

2.1.6 抗壞血酸鹽對玉米棒中葉酸得率的影響

在抗氧化的單因素試驗中，考慮到試驗成本、抗氧化效果，以及提取體系下葉酸的最適酸堿度為弱堿性，選擇抗壞血酸鹽（抗壞血酸鈉） 作為抗氧化劑。即在提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化抗壞血酸鹽用量。

抗壞血酸鹽對提取玉米葉酸得率的影響見圖7。

圖7 抗壞血酸鹽對提取玉米葉酸得率的影響

由圖7 可知，抗壞血酸鹽在0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 g 這5 個用量水平下，隨著用量的增加，葉酸得率先增加再降低，在添加1.00 g 后，葉酸得率開始下降，所以抗壞血酸鹽在該梯度下，提取過程中添加1.00 g 抗壞血酸鹽為最適量，對葉酸保護效果較好。

為了試驗結(jié)果的準確性，需要在提取葉酸的提取液中加入去除淀粉、植物蛋白、防止葉酸氧化及穩(wěn)定葉酸結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，在稱取α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、pH 值、抗壞血酸鹽、β - 巰基乙醇時盡量統(tǒng)一稱取，較少試驗誤差。在操作過程中，盡可能在低溫和避光的環(huán)境下進行，對于試驗所用到的容器，也盡量使用棕色瓶，試驗過程中也可以通過使用封口膜來防止樣品有雜質(zhì)混入或者溫度升高。在純化樣品過程中，加入適量的β - 巰基乙醇，能很好地保護5- 甲基四氫葉酸，盡可能減少損失。

在α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、pH 值、抗壞血酸鹽、β - 巰基乙醇這6 種單因素下，計算出這6 項單因素的最優(yōu)葉酸含量分別16.45，16.72，18.25，16.95，16.39，16.39 μg/μL。

葉酸提取優(yōu)化條件見表2。

表2 葉酸提取優(yōu)化條件

由表2 可知，大鼠血清的最優(yōu)用量對葉酸的保護效果較好，所得峰面積較大，測定的葉酸含量較高，單因素中以pH 值影響較小，所以確定在保護葉酸的試驗中，優(yōu)先使用大鼠血清作為樣品軛和酶。

2.2 不同加工方法下葉酸的提取結(jié)果及分析

應用單因素確定的最優(yōu)條件3 種不同加工方式進行不同方式下葉酸的測定，對比3 種加工條件下的葉酸含量，確定何種加工方式下葉酸的穩(wěn)定性更佳。

不同加工方式測定結(jié)果見表3。

表3 不同加工方式測定結(jié)果

由表3 可知，蒸制即食玉米棒中提取出的葉酸含量為22.73 μg/μL，明顯高于煮制、微波的加工方法，蒸制為最優(yōu)加工方式。對比其他3 種加工方式，在6 項單因素完全相同的提取液中，避光操作試驗下，葉酸含量呈現(xiàn)蒸制3 min ＞微波40 s ＞煮制2 min。

3 結(jié)論

通過單因素試驗，結(jié)合對比3 種不同加工方式下提取即食玉米棒中葉酸含量試驗中出現(xiàn)的問題。

通過單因素試驗結(jié)合對比3 種不同加工方式來優(yōu)化即食玉米棒中葉酸的提取工藝，確定葉酸在何種單因素和加工方式下更加穩(wěn)定。在葉酸的提取過程中，α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、β - 巰基乙醇、pH 值、抗壞血酸鹽經(jīng)過HPLC 測定后得出的最優(yōu)條件為100，30，70，500 μL；pH 值7.5，1 g。對葉酸得率的影響程度為蒸制3 min，加工測定的葉酸含量22.73 μg/μL＞微波40 s 加工測定的葉酸含量19.76 μg/μL＞煮制2 min 加工測定的葉酸含量17.57 μg/μL。結(jié)果表明，煮制的條件下葉酸的損失率較大。