高詩宇，吳力群，馬 佳，李盼盼，路 晨，聶 力

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)為兒童呼吸系統(tǒng)常見疾病，是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分共同參與的慢性氣道炎性疾病，臨床上主要分為緩解期、慢性持續(xù)期、急性發(fā)作期[1]。其中兒童哮喘的慢性持續(xù)期是疾病轉(zhuǎn)歸預(yù)后的關(guān)鍵時期，常表現(xiàn)為反復(fù)不同程度的喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀，嚴(yán)重影響兒童的身心健康及生活質(zhì)量[2-3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，哮喘屬于“哮證”“喘證”等范疇，其慢性持續(xù)期的基本病機(jī)為痰瘀互結(jié)，以健脾祛痰、溫肺平喘為治法[4]。中醫(yī)藥在哮喘治療中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢，導(dǎo)師吳力群教授多年來致力于小兒哮喘的治療，于繼承四川省名中醫(yī)胡天成教授學(xué)術(shù)思想基礎(chǔ)上，化裁古方六安煎，并結(jié)合數(shù)十年臨床經(jīng)驗(yàn)自擬緩哮六安煎，可明顯改善哮喘癥狀并控制哮喘發(fā)作水平[5]。本方中以半夏燥濕化痰為君；橘紅理氣化痰燥濕，茯苓健脾滲濕，以絕生痰之源，共為臣藥；杏仁潤燥而化痰止咳，白芥子行氣而化痰，海浮石軟堅(jiān)而消痰，瓜蔞皮清熱而化痰，佐助君臣；葶藶子瀉肺平喘，甘草調(diào)和諸藥，地龍解痙止咳共為佐使，上述諸藥共奏健脾理氣、化痰通絡(luò)之效。但緩哮六安煎治療哮喘的機(jī)制尚不明確，現(xiàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測緩哮六安煎治療哮喘的物質(zhì)基礎(chǔ)及核心靶點(diǎn)，從網(wǎng)絡(luò)層面系統(tǒng)綜合地闡述分子靶標(biāo)在疾病中的作用機(jī)制，為緩哮六安煎治療哮喘提供參考。

1 材料與方法

1.1緩哮六安煎成分靶點(diǎn)的獲取 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)獲取半夏、橘紅、茯苓、苦杏仁、海浮石、瓜蔞、白芥子、葶藶子及甘草的活性成分及成分靶點(diǎn)，通過BATMAN-TCM、NCBI、TCM-ID數(shù)據(jù)庫獲取海浮石及地龍的活性成分，再通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取活性成分的SMILLS機(jī)構(gòu)，輸入到SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫獲取其成分靶點(diǎn)。將活性成分作用靶點(diǎn)統(tǒng)一在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2兒童哮喘靶點(diǎn)的獲取 以“Bronchial asthma in children”作為關(guān)鍵詞，通過OMIM及GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取兒童哮喘的有效靶點(diǎn)。在Genecards數(shù)據(jù)庫中，分值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切，故取相關(guān)打分值≥20的靶點(diǎn)為兒童哮喘的潛在靶點(diǎn)。合并兩個數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)性后，即為兒童哮喘的靶點(diǎn)。再將上述得到的緩哮六安煎的成分靶點(diǎn)與兒童哮喘的靶點(diǎn)依次輸入到Venny平臺，得到的交集靶點(diǎn)即為緩哮六安煎治療兒童哮喘靶點(diǎn)。

1.3成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述獲取的緩哮六安煎成分靶點(diǎn)與交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中，獲取緩哮六安煎成分靶點(diǎn)-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。并借助Cytoscape分析軟件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)代表成分和靶點(diǎn)，邊代表成分和靶點(diǎn)的關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)中Degree值越大表明節(jié)點(diǎn)越重要。最后，選取Degree值排名靠前的成分作為核心成分。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了系統(tǒng)地探討緩哮六安煎與兒童哮喘靶點(diǎn)間的網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用，采用String數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，設(shè)置物種為“智人”種，最小交互打分值為0.7構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。再將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，借用Cytoscape分析軟件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。選取Degree值排名靠前的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.5GO富集分析和KEGG通路分析 采用DAVID平臺，設(shè)置物種為“智人”種對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，其中GO富集分析包括生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組成(CC)3個分支。根據(jù)Pvalue值，選取結(jié)果較好的過程和通路采用R語言進(jìn)行做圖分析。

1.6核心成分與核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證 將上述核心成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。將核心靶點(diǎn)的Uniprot ID輸入RSB PDB數(shù)據(jù)庫中，獲取核心的晶體結(jié)構(gòu)；在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點(diǎn)的mol2格式，再采用ChemDraw 3D軟件進(jìn)行能量最小化。采用Autodock軟件對核心靶點(diǎn)進(jìn)行去水加氫、去配體及氨基酸的修補(bǔ)處理并保存為PDBQT形式。最后，采用Autodock Vina軟件進(jìn)行對接處理，以結(jié)合能大小衡量對接結(jié)果，結(jié)合能越小代表其對接結(jié)果越好。本研究以結(jié)合能≤-5 kJ/mol表明兩者具有較好的相互作用[6]。

2 結(jié) 果

2.1緩哮六安煎的活性成分及成分靶點(diǎn) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分別獲得半夏13個、橘紅9個、茯苓15個、苦杏仁19個、瓜蔞11個、白芥子3個、葶藶子12個及甘草92個活性成分。通過BATMAN-TCM、NCBI、TCM-ID數(shù)據(jù)庫獲得海浮石2個、地龍2個活性成分。剔除重復(fù)項(xiàng)及無靶點(diǎn)成分后，總共得到129個活性成分。獲得成分靶點(diǎn)2 518個，剔除重復(fù)項(xiàng)后得到緩哮六安煎成分靶點(diǎn)592個。

2.2兒童哮喘的靶點(diǎn) 通過OMIM及GeneCards數(shù)據(jù)庫分別獲得兒童哮喘靶點(diǎn)689，189個，剔除重復(fù)項(xiàng)后得到866個兒童哮喘靶點(diǎn)。與緩哮六安煎成分靶點(diǎn)取交集，得到177個緩哮六安煎治療兒童哮喘的靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 緩哮六安煎與兒童支氣管哮喘靶點(diǎn)韋恩圖

2.3緩哮六安煎與兒童哮喘的成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將上述得到的緩哮六安煎成分與交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytocape中，構(gòu)建成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。圖中綠色代表活性成分，紅色代表交集靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中包含306個節(jié)點(diǎn)和1 146條邊。根據(jù)Degree值篩選得到槲皮素、山柰酚及7-甲氧基-2-甲基異黃酮等10個成分為核心成分，具體信息見表1。

表1 緩哮六安煎治療兒童支氣管哮喘的核心成分信息表

圖2 緩哮六安煎與兒童支氣管哮喘成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用String數(shù)據(jù)庫，對交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白間相互作用分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。網(wǎng)絡(luò)中包含177個節(jié)點(diǎn)，1 447條邊，平均節(jié)點(diǎn)16.4個。借助Cytoscape軟件分析發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF及EGFR等10個靶點(diǎn)的Degree值排名靠前，為緩哮六安煎治療兒童哮喘的核心靶點(diǎn)，具體信息見表2。

表2 緩哮六安煎治療兒童支氣管哮喘的核心靶點(diǎn)信息表

圖3 緩哮六安煎與兒童支氣管哮喘交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5GO富集分析與KEGG通路分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對緩哮六安煎與兒童哮喘的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)主要涉及2 809條生物過程，包括對脂多糖、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)及藥物反應(yīng)等；74個細(xì)胞組成包括膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔；157條分子功能，包括受體配體活性、信號受體激活劑活性及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，根據(jù)P值分別篩選前10條做圖，見圖4。KEGG通路分析得到TNF、IL-17及MAPK等178條信號通路，根據(jù)P值篩選前20條及通路做圖，見圖5。

圖4 緩哮六安煎與兒童支氣管哮喘的交集靶點(diǎn)GO富集分析圖

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了清晰地了解靶點(diǎn)在通路中的分布情況，將上述得到的前20條通路及對應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中，構(gòu)建通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖6)，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的大小表示其對應(yīng)的Degree值的大小。分析發(fā)現(xiàn)緩哮六安煎主要作用于IL-6、MAPK、AKT1等靶點(diǎn)，調(diào)控TNF、IL-17及MAPK等通路發(fā)揮治療兒童哮喘的作用。本結(jié)果與上述預(yù)測的核心靶點(diǎn)基本一致，再次驗(yàn)證了PPI網(wǎng)分析的準(zhǔn)確性。

圖6 通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.7分子對接驗(yàn)證 采用Autodock Vina對前10個核心靶點(diǎn)和核心成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證(見圖7)，結(jié)果顯示其對接結(jié)合能均<-5kJ/mol，表明核心靶點(diǎn)和核心成分對接良好，也再次驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的準(zhǔn)確性。其中quercetin與IL-6、licochalcone a與EGFR的結(jié)合能最低，分別為-9.9，-10 kJ/mol，用Pymol軟件對其繪圖(見圖8)，由圖可見quercetin與IL-6在SER，TYR，GLN，CYS，HIS，TRP形成氫鍵，在MET、ARG、ASN處形成氫鍵，因此具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

圖7 分子對接熱圖

圖8 quercetin與IL-6及l(fā)icochalcone a與EGFR分子對接模式圖

3 討 論

哮喘是一種持續(xù)的慢性氣道炎癥性疾病，其基本病理特征為氣道炎癥、氣道黏液高分泌及氣道重塑等[7]。隨著環(huán)境污染及人們生活環(huán)境的改變，近年來哮喘的發(fā)病率逐年上升，目前全球約有3.34億人受到哮喘的影響且兒童占10%[8]。哮喘的治療目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)良好的控制，即最大限度地減少癥狀負(fù)擔(dān)和加重風(fēng)險，指南將吸入性糖皮質(zhì)激素、長效β2受體激動劑、白三烯受體拮抗劑等列為兒童哮喘常用藥物[9]。吸入性糖皮質(zhì)激素是控制哮喘的首選藥物，可通過改善氣道慢性炎癥，減輕氣道黏液異常高分泌治療哮喘，但停藥后易復(fù)發(fā)；而且該藥長期應(yīng)用可影響兒童生長發(fā)育[10-11]，從而導(dǎo)致患兒家長依從性差[12]。因此為臨床尋找全有效的藥物迫在眉睫。

中醫(yī)中藥治療兒童哮喘優(yōu)勢近年來受到重視，眾多學(xué)者也開始研究中藥復(fù)方治療哮喘的作用機(jī)制。已有研究證實(shí)，由半夏、橘紅、茯苓、苦杏仁、海浮石、瓜蔞、白芥子、葶藶子、地龍及甘草組成的緩哮六安煎在改善兒童哮喘癥狀及控制哮喘方面具有顯著療效[5]，但其治療哮喘的藥理作用機(jī)制尚不明確。中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)及多通路治療疾病的模式與網(wǎng)絡(luò)藥理系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)相一致，因此使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討緩哮六安煎抗哮喘的分子機(jī)制較適宜。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討緩哮六安煎抗哮喘的相關(guān)分子機(jī)制，可以為臨床上擴(kuò)大其應(yīng)用范圍及后續(xù)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

本研究從TCMSP、BATMAN-TCM、NCBI及TCM-ID數(shù)據(jù)庫共獲取緩哮六安煎的活性成分129個，通過結(jié)合藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)信息構(gòu)建“成分-交集靶點(diǎn)”復(fù)合網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，緩哮六安煎治療兒童哮喘的核心成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇及甘草查爾酮A等。槲皮素能夠調(diào)節(jié)免疫、擴(kuò)張支氣管而發(fā)揮抗哮喘的作用[13]。亦有研究表明，槲皮素可通過下調(diào)IL-4、IL-5和miR-155表達(dá)改善哮喘小鼠氣道炎癥而對哮喘具有緩解作用[14]。山柰酚及異鼠李素具有治療哮喘及支氣管炎的作用[15]。山柰酚可通過抑制過敏性哮喘小鼠的氣道增生及增厚，減輕肺組織炎癥反應(yīng)來緩解哮喘反應(yīng)[16]。異鼠李素治療通過下調(diào)NF-κB信號通路來降低脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[17]。β-谷甾醇能夠抑制TNF-α、IL-6的釋放并下調(diào)NF-κB信號通路的表達(dá)而對肺組織起保護(hù)作用[18]。甘草查爾酮A可抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖而緩解哮喘氣道重塑，其作用機(jī)制可能與抑制VEGFR2和ERK1/2的活性有關(guān)[19]。

PPI網(wǎng)絡(luò)及富集分析結(jié)果表明，緩哮六安煎可能通過IL-6、TNF及EGFR等177個靶點(diǎn)調(diào)控TNF、IL-17及MAPK等178條信號通路發(fā)揮治療兒童哮喘的作用。TNF-α及IL-6為重要的炎癥因子，在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫等多種病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。研究顯示，下調(diào)IL-6和TNF-α等炎癥因子水平，可減輕肺部炎癥，進(jìn)而改善哮喘氣道高反應(yīng)性及氣道重塑[20-21]。通過抑制TNF信號通路能夠減少炎癥介質(zhì)的合成，緩解氣道黏液高分泌及氣道重塑，發(fā)揮治療哮喘的作用[22]。由Th17細(xì)胞分泌的IL-17與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，其可加重氣道炎癥反應(yīng)、促進(jìn)氣道黏液分泌及氣道重塑，進(jìn)而加重哮喘癥狀[23]。此外，IL-17在哮喘患者體內(nèi)高表達(dá)可刺激IL-6等趨化因子的產(chǎn)生與募集，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[24]。EGFR是人表皮生長因子受體家族成員，為氣道上皮細(xì)胞中功能的調(diào)控者，且在慢性氣道炎性反應(yīng)中表達(dá)呈增加趨勢。下調(diào)EGFR可減少杯狀細(xì)胞增生和黏液高分泌，進(jìn)而減輕哮喘氣道重塑[25]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號傳導(dǎo)通路可介導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，廣泛參與炎癥的發(fā)生發(fā)展[26]。李俊峰等[27]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制MAPK信號通路，可減少哮喘小鼠氣道炎性細(xì)胞的浸潤而改善哮喘氣道炎癥反應(yīng)。以上報道結(jié)果均與本研究的預(yù)測結(jié)果相一致，說明本研究結(jié)果具有有一定可信度。通過分子對接技術(shù)，將篩選出的前10個核心靶點(diǎn)和核心成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)果顯示核心靶點(diǎn)和核心成分對接良好，進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的準(zhǔn)確性。

綜上所述，緩哮六安煎可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇及甘草查爾酮A等129個活性成分作用于IL-6、TNF及EGFR等177個靶點(diǎn)調(diào)控TNF、IL-17及MAPK等178條信號通路對兒童哮喘起治療作用。因此，緩哮六安煎抗哮喘的藥理作用是通過多成分、多靶點(diǎn)及多通路的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，其具體的作用機(jī)制需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。