陳 六,鄭翼馳,陳 露,王權(quán)勝

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

少精子癥是男性不育癥的重要影響因素之一，近年來該病發(fā)病率較高。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)續(xù)斷種子方治療少弱精子癥療效顯著，有效率高達(dá)80.3%[1]；實驗研究發(fā)現(xiàn)續(xù)斷種子方在精子發(fā)生發(fā)育過程中起調(diào)控作用，不僅能有效促進精子的發(fā)生發(fā)育，更能顯著提高生精細(xì)胞氧化損傷修復(fù)能力，可有效修復(fù)睪丸氧化損傷[2-5]。精子相關(guān)抗原6(sperm-associated antigen 6, SPAG6)作為一種參與精子發(fā)生發(fā)育的重要蛋白，有研究表明其在弱精子癥患者精子中表達(dá)量明顯下降[6]；且SPAG6缺失可造成野生雄性小鼠精子成長發(fā)育不全，導(dǎo)致小鼠不育[7]?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，本實驗探討了續(xù)斷種子方對少精子癥模型大鼠睪丸組織中SPAG6表達(dá)的影響，以期為后續(xù)臨床及實驗研究提供基礎(chǔ)與思路。

1 實驗材料與方法

1.1主要實驗儀器 WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司)，EG1150H+C型石蠟包埋機(德國Leica公司)，F(xiàn)inesse E+型半自動輪轉(zhuǎn)切片機(美國ThermoShandon公司)，BX43型光學(xué)生物顯微鏡(日本Olympus公司)，半干式轉(zhuǎn)移電泳槽(JUNYI公司)，全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)(上海天能)，臺式冷凍離心機(德國eppendorf )，渦旋混合器(江蘇省金壇市榮華實驗器材有限公司)，酶標(biāo)儀 (BioTek Epoch)，電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，熒光定PCR儀(德國AnalytikJena公司)。

1.2主要實驗試劑 4%聚氯甲醛，蘇木精-伊紅染液，動物組織總RNA提取試劑盒(天根)，HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (諾維贊)，抗β-actin抗體(生工公司，生產(chǎn)批號：D110001)，抗SPAG6抗體(abcam公司，生產(chǎn)批號：ab155653)，蛋白裂解液(碧云天)，BeyoECL Plus ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天)，兔抗SPAG6多隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：bs-12291R)。

1.3主要實驗藥物 環(huán)磷酰胺(Baxter公司，注冊證號H20160467，規(guī)格：200 mg)，左卡尼汀口服溶液(大連美羅中藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H20103448，規(guī)格：10 mL∶1 g)，續(xù)斷種子方顆粒(由續(xù)斷15 g、骨碎補15 g、杜仲15 g、牛膝15 g、菟絲子15 g、枸杞子10 g、女貞子10 g、黨參15 g、白術(shù)10 g、山藥15 g組成，免煎中藥,江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司,產(chǎn)品批號：1203002)。

1.4實驗動物及分組 45只SPF級SD雄性大鼠, 6～8周齡，體重240～250 g,湖南安生美藥物研究有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2019-0004。實驗動物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗房，自由采光，喂養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃，飼料及飲用水喂養(yǎng)1 d/次，墊料更換3 d/次。

1.5實驗方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機取11只作為空白組(造模期間腹腔注射生理鹽水)，余34只參考文獻[8]方法建立少精子癥模型：200 mg環(huán)磷酰胺中加入10 mL生理鹽水稀釋后，以100 mg/kg劑量持續(xù)腹腔注射7 d，然后隨機取4只大鼠檢測精子質(zhì)量，若精子濃度及活力明顯低于空白組，則提示造模成功。將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組、續(xù)斷種子方組及左卡尼汀組，每組10只。續(xù)斷種子方組予續(xù)斷種子方溶液10 g/kg灌胃，左卡尼汀組予左卡尼汀口服溶液100 mg/kg灌胃，空白組及模型組予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，持續(xù)8周。喂養(yǎng)過程中，左卡尼汀組死亡1只。

1.6取材方法 末次灌胃并禁食24 h后將各組大鼠以頸椎脫臼法處死，開腹取出雙側(cè)睪丸及附睪并分離游離脂肪等。

1.7檢測指標(biāo)及方法

1.7.1精子質(zhì)量檢測 將獲取的各組大鼠附睪組織放于5 mL清潔量杯中剪碎，37 ℃恒溫水浴箱中充分游離后，采用精子計數(shù)板及精子檢測系統(tǒng)進行精液分析，參考第5版《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》[9]對精子質(zhì)量進行評估。

1.7.2睪丸組織HE染色觀察 取各組大鼠部分睪丸組織，于4%聚氯甲醛中固定后，進行脫水、埋蠟、切片、蘇木精伊紅染色處理，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7.3睪丸組織SPAG6蛋白表達(dá)免疫組化觀察取各組大鼠部分睪丸組織，加入Anti-SPAG6抗體，常規(guī)制備石蠟切片后，免疫組化法觀察各組大鼠睪丸組織中SPAG6蛋白表達(dá)情況。

1.7.4睪丸組織SPAG6蛋白表達(dá)Western blot檢測 將各組大鼠部分睪丸組織研磨粉碎置于1.5 mL EP管中，加入10倍體積蛋白裂解液進行裂解，然后離心、煮沸變性，提取SPAG6總蛋白，進行SDS-Page膠電泳檢測蛋白濃度及質(zhì)量，電泳后對樣本轉(zhuǎn)膜封閉。取封閉膜在TBST(3次，10 min)和TBS(1次，10 min)中進行震蕩洗滌(頻率80次/min)后加入一抗，在4 ℃下孵育過夜；孵育后以前法2次震蕩洗滌加入二抗，室溫孵育1 h；3次震蕩洗滌后在膜上滴加化學(xué)發(fā)光液在成像系統(tǒng)進行曝光成像。SPAG6蛋白相對表達(dá)量=SPAG6蛋白/β-actin。

1.7.5睪丸組織SPAG6 mRNA實時熒光定量PCR檢測 使用天根《動物組織總RNA提取試劑盒》，嚴(yán)格按照操作說明提取各組大鼠睪丸組織SPAG6總RNA，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳30 min檢測RNA完整性后，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA；以cDNA為主體加入引物、SYBR Green Master Mix和無酶水等制備混合反應(yīng)溶液，對其進行預(yù)熱、PCR循環(huán)以及溶解曲線；完成上述步驟后，將加樣的Array孔板置于熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)檢測。引物序列：SPAG6上游引物5’-GCTGAGACCTCTTCTTCTGGAT-3’,下游引物5’-CCTTCACAACTGCTTCTGCTAA-3’，產(chǎn)物110 bp；GAPDH上游引物5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’,下游引物5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’，產(chǎn)物92 bp。各組SPAG6 mRNA的相對表達(dá)量以2-ΔΔct表示，ΔΔct=(目標(biāo)基因CT-目標(biāo)內(nèi)參基因CT)-(空白基因CT-空白內(nèi)參基因CT)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠精子質(zhì)量比較 模型組大鼠精子濃度及活力均明顯低于空白組(P均<0.05)；續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組大鼠精子濃度及活力均明顯高于模型組(P均<0.05)，且續(xù)斷種子方組均明顯高于左卡尼汀組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和少精子癥各組大鼠精子濃度及活力比較

2.2各組大鼠睪丸組織HE染色情況 空白組生精上皮形狀規(guī)則，厚度正常；生精小管飽滿且有序密集排列，腔內(nèi)可見大量精子細(xì)胞；各生精上皮間充斥大量間質(zhì)細(xì)胞。模型組生精上皮嚴(yán)重變形，厚度變??；生精小管雜亂干癟，且數(shù)量減少，腔內(nèi)僅可見少量成型精子細(xì)胞；間質(zhì)細(xì)胞明顯減少。左卡尼汀組及續(xù)斷種子方組較模型組情況明顯改善；續(xù)斷種子方組與左卡尼汀組相比，生精上皮更加規(guī)則有序，生精小管相對密集，精子細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞更加豐富。見圖1。

圖1 空白組和少精子癥各組大鼠睪丸組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組大鼠免疫組化染色睪丸組織中SPAG6蛋白表達(dá)情況 空白組大鼠睪丸生精小管、生精上皮、精子細(xì)胞中可見密集黃褐色SPAG6蛋白表達(dá)；模型組可見少量SPAG6蛋白表達(dá)；左卡尼汀組及續(xù)斷種子方組SPAG6蛋白表達(dá)較模型組明顯增加，且續(xù)斷種子方組較左卡尼汀組多。見圖2。

圖2 空白組和少精子癥各組大鼠睪丸組織中SPAG6蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

2.4各組大鼠睪丸組織中SPAG6蛋白表達(dá)情況模型組大鼠睪丸組織中SPAG6蛋白相對表達(dá)量明顯低于空白組(P<0.05)；續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組大鼠睪丸組織中SPAG6蛋白相對表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且續(xù)斷種子方組明顯高于左卡尼汀組(P<0.05)。見圖3和圖4。

圖3 空白組和少精子癥各組大鼠睪丸組織中SPAG6蛋白及內(nèi)參表達(dá)條帶

圖4 空白組和少精子癥各組大鼠睪丸組織中SPAG6蛋白相對表達(dá)量

2.5各組大鼠睪丸組織中SPAG6 mRNA表達(dá)情況模型組大鼠睪丸組織中SPAG6 mRNA相對表達(dá)量明顯低于空白組(P<0.05)；續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組大鼠睪丸組織中SPAG6 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，續(xù)斷種子方組與左卡尼汀組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 空白組和少精子癥各組大鼠睪丸組織中SPAG6 mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，在眾多不孕不育家庭中，男性因素占比高達(dá)50%[10]。男性不育癥病因復(fù)雜，臨床以精索靜脈曲張、內(nèi)分泌失調(diào)及精子異常較為多見，其中精子異常就包括少精子癥。第5版《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》[9]指出：精子總數(shù)(或濃度)低于39×106(15×106/mL)即為少精子癥。

環(huán)磷酰胺臨床上多用于免疫系統(tǒng)疾病沖擊治療，其代謝副產(chǎn)物丙烯醛有強毒性及強氧化能力，能夠損傷男性精子總量及活力，致使少無精子癥的發(fā)生[11]。環(huán)磷酰胺損傷睪丸生精功能作用機制尚未明確，實驗研究中少精子癥模型動物的制備多使用小鼠，但有研究顯示環(huán)磷酰胺可通PP2A和β-catenin信號通路損傷大鼠睪丸組織，導(dǎo)致大鼠精子質(zhì)量的下降[12]，因此本實驗參考相關(guān)文獻，以環(huán)磷酰胺影響大鼠睪丸生精功能制備少精子癥模型。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠較空白組大鼠生精上皮、生精小管明顯變質(zhì)，管腔內(nèi)成形精子細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞明顯減少，提示環(huán)磷酰胺可用于大鼠少精子癥模型的建立。

左卡尼汀別名左旋肉堿，廣泛存在于人體組織及血漿中，其中附睪中表達(dá)量最高[13]。有研究顯示，左卡尼汀直接參與精子的發(fā)育過程，與精子的活力及濃度密切相關(guān)，附睪組織左卡尼汀的缺失可能直接導(dǎo)致少弱精子癥的發(fā)生；同時附睪微環(huán)境的氧化應(yīng)激反應(yīng)也會導(dǎo)致精子形態(tài)異常，進而引發(fā)男性不育[14-15]。左卡尼汀作為目前臨床治療男性不育癥的常規(guī)用藥，對少弱精子癥、畸形精子癥及生殖系統(tǒng)炎癥所致男性不育均有獨特療效，其不僅為精子發(fā)育成熟提供必不可少的能量[16]，更能提高附睪抗氧化能力[17]，為精子發(fā)生發(fā)育提供安全穩(wěn)定的微環(huán)境。本研究中，左卡尼汀組大鼠精子濃度及活力明顯高于模型組，再次驗證了左卡尼汀提高精子質(zhì)量的有效性及對少精子癥的適用性。

少精子癥在古代相關(guān)文獻中涉及較少，可歸為“精少”“精清”“精冷”等范疇。古今各家大多認(rèn)為其病位在腎，與肝、脾密切相關(guān)，主要病機可歸為腎虛夾痰、濕、瘀、滯等[18]?！端貑枴び駲C真藏論》：“脾為孤藏，中央土以灌四傍，脾精之濃厚者化營化血，輕清者化衛(wèi)化氣?！薄端貑枴ち?jié)藏相論》“腎者，主哲封藏之本，精之處也”，即腎藏父母所賦先天之精與脾胃所化后天之精，脾失所化，則營氣不從，腎無所藏，則腎精虧虛。治當(dāng)健脾益腎、活血生精。續(xù)斷種子方出自明醫(yī)岳甫嘉所書《醫(yī)學(xué)正印》：“補腎健脾益氣種子煎方”，其認(rèn)為脾所化精神氣血，乃生精種子之生息之源，此方生精最速，輔以適當(dāng)禁欲，更能得子。續(xù)斷種子方中續(xù)斷、骨碎補、杜仲、牛膝、菟絲子、枸杞子、女貞子、山藥均有補腎生精之功，續(xù)斷、骨碎補兼有活血通經(jīng)之效，黨參、白術(shù)及山藥則能健脾養(yǎng)血，諸藥合用，共奏生精種子之力?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，杜仲、菟絲子、牛膝、枸杞子、骨碎補、女貞子、黨參中含有豐富的天然黃酮類化合物，如槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、山柰酚等，具有抗氧化、抗炎及調(diào)控細(xì)胞凋亡等作用[19-22]。 續(xù)斷、杜仲、骨碎補、菟絲子、牛膝、枸杞子、女貞子中則含有豐富的β-谷甾醇(天然多酚羥酸類化合物)，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經(jīng)保護作用[23]。本實驗結(jié)果顯示，續(xù)斷種子方組大鼠精子濃度及活力均高于模型組和左卡尼汀組，大鼠睪丸生精上皮、生精小管及精子細(xì)胞損傷情況較模型組明顯改善，且改善情況明顯優(yōu)于左卡尼汀組。提示續(xù)斷種子方能有效提高少精子癥模型大鼠精子質(zhì)量。

SPAG6最早是研究男性不育的克隆基因[24]，后被歸為癌睪丸抗原家族，其高表達(dá)于睪丸、附睪組織及腫瘤組織中，參與精子運動、發(fā)育及腫瘤的形成，具有蛋白調(diào)節(jié)及交互作用功能[25]。相關(guān)研究顯示：SPAG6定位于圓形精子頂體，能與絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPINK2)、T復(fù)合體相關(guān)睪丸表達(dá)3 (TCTE3)和COP9信號復(fù)合體亞基5(COPS5)相互作用，調(diào)控精子發(fā)生發(fā)育過程[7，26-27]。本實驗結(jié)果顯示，續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組睪丸組織中SPAG6蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯高于模型組，且續(xù)斷種子方組SPAG6蛋白表達(dá)量明顯高于左卡尼汀組。證明SPAG6參與精子發(fā)生發(fā)育過程，續(xù)斷種子方可能通過調(diào)控SPAG6表達(dá)影響少精子癥模型大鼠精子質(zhì)量。

綜上，環(huán)磷酰胺適用于少精子癥模型大鼠造模；SPAG6參與精子發(fā)生發(fā)育過程，續(xù)斷種子方可能通過調(diào)控SPAG6表達(dá)而提高少精子癥模型大鼠精子質(zhì)量，為少精子癥的治療提供了新的作用靶點，后續(xù)可深入研究SPAG6及其相互作用蛋白與少精子癥的關(guān)系，為少精子癥的研究提供更多新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。