黃鑫昱 蘇盛元 王開琛 王甘露

肝癌(Hepatocellular carcinoma， HCC)占全球原發(fā)性癌癥的80%以上[1]，5年總體生存率僅為10%。諸多研究表明，炎癥，特別是慢性炎癥，如慢性乙型肝炎，是影響肝癌發(fā)生、發(fā)展最重要的因素[2]，而巨噬細(xì)胞大量積聚是慢性炎癥的重要特征。巨噬細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了“雙刃劍”。一方面，巨噬細(xì)胞通過固有免疫殺死并清除病變細(xì)胞；另一方面，巨噬細(xì)胞的極強(qiáng)可塑性(plasticity)，使其在腫瘤微環(huán)境下，可迅速轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲，新生血管生成以及具有免疫調(diào)節(jié)功能。此外，巨噬細(xì)胞與肝癌耐藥性密切相關(guān)[3]。因此，通過靶向清除或轉(zhuǎn)化巨噬細(xì)胞及中和其代謝產(chǎn)物成為肝癌研究熱點(diǎn)。

一、肝巨噬細(xì)胞的來源和異質(zhì)性

動(dòng)物和臨床研究表明，肝臟巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的異質(zhì)性。根據(jù)來源不同，分為組織固有(tissue-resident)的巨噬細(xì)胞和單核來源(monocyte-derived)的巨噬細(xì)胞。肝臟組織固有的巨噬細(xì)胞，即庫(kù)普弗細(xì)胞，主要由卵黃囊的紅系髓樣祖細(xì)胞發(fā)育而來，它們?cè)谂咛r(shí)就進(jìn)入肝臟，能自我更新，對(duì)肝臟穩(wěn)態(tài)和免疫耐受具有重要作用[4]。在正常生理?xiàng)l件下，單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞數(shù)量較少，約占5%～30%[5]，當(dāng)肝組織損傷時(shí)，會(huì)招募大量單核細(xì)胞進(jìn)入組織。根據(jù)表型和功能差異，巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2)。M1型巨噬細(xì)胞釋放的趨化因子、細(xì)胞因子以及蛋白水解酶，能誘發(fā)各類白細(xì)胞浸潤(rùn)和活化，并具有強(qiáng)大的抗原遞呈能力，因此，參與對(duì)病原體及病變細(xì)胞的免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視功能；M2型巨噬細(xì)胞，主要由IL-4和IL-13誘導(dǎo)活化，其抗原遞呈能力較弱，分泌抑制性細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β，在免疫調(diào)控和組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[6]。

二、巨噬細(xì)胞在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制

諸多研究證明，腫瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage, TAM)在腫瘤免疫逃逸、腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤血管生成等過程中發(fā)揮了重要作用[7]。一方面，在腫瘤發(fā)生初期，巨噬細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，可直接識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，并招募和活化T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫響應(yīng)；另一方面，巨噬細(xì)胞作為腫瘤組織中最為豐富的免疫細(xì)胞，在局部組織產(chǎn)生大量活性氧和活性氮，導(dǎo)致DNA損傷及基因組不穩(wěn)定[6]；同時(shí)，損傷的組織細(xì)胞刺激巨噬細(xì)胞不斷產(chǎn)生各類生長(zhǎng)因子，使細(xì)胞增殖異常活躍。因此，不同階段TAM對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響截然不同，與之相應(yīng)的，TAM功能表型也由早期的M1型逐步極化為M2型。此外，腫瘤細(xì)胞分泌多種趨化因子，如CCL2和M-CSF[8-9]，招募單核細(xì)胞進(jìn)入組織并分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步強(qiáng)化巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤發(fā)展的作用。

多個(gè)臨床研究也證實(shí)，肝癌組織中巨噬細(xì)胞的密度與腫瘤大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況、TNM分級(jí)以及不良預(yù)后(如生存期、耐藥性)密切相關(guān)[10]。我們將重點(diǎn)闡述TAM影響肝癌發(fā)生、發(fā)展作用機(jī)制，以及靶向清除或轉(zhuǎn)化巨噬細(xì)胞及中和其代謝產(chǎn)物相關(guān)治療方案的研究進(jìn)展。

(一)構(gòu)建免疫耐受的腫瘤微環(huán)境

與M2型巨噬細(xì)胞類似，TAM抗原遞呈能力差，而且其釋放的精氨酸酶1、IL-10和TGF-β 能抑制T細(xì)胞的抗腫瘤活性。Kuang等[11]發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，單核細(xì)胞來源的TAM通過TNF-α和IL-10以自分泌的方式上調(diào)PD-L1的表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞的增殖和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。利用PD-L1抗體阻斷PD-L1后，可解除TAM對(duì)T細(xì)胞腫瘤的免疫抑制，并抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。近年來Wu等[13]也報(bào)道了類似結(jié)果。他們發(fā)現(xiàn)，TREM-1+TAMs富集在肝癌的缺氧區(qū)域，并且與不良預(yù)后相關(guān)。TREM-1+TAMs通過上調(diào)PD-L1表達(dá)，抑制CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。TIM-3是一種T細(xì)胞表面抑制分子，結(jié)合配體后，能夠引起T細(xì)胞的衰竭。Li等[14]發(fā)現(xiàn)，在HBV相關(guān)HCC患者肝癌組織內(nèi)的TAM高表達(dá)TIM-3的配體分子galectin-9。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，在肝癌組織中，TIM-3+T細(xì)胞與galectin-9+TAM相鄰分布。阻斷galectin-9與TIM-3相互作用，能逆轉(zhuǎn)腫瘤侵潤(rùn)的T細(xì)胞耗竭并恢復(fù)它們?cè)鲋澈头置诩?xì)胞因子的功能。

此外，多個(gè)臨床研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者肝癌組織中的Tregs數(shù)量顯著多于癌旁和正常組織[15]，多變量分析表明，Tregs密度是HCC不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[16]。Zhou等[17]發(fā)現(xiàn)，肝癌腫瘤組織內(nèi)Tregs數(shù)量與TAM密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，清除肝臟組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞能顯著降低腫瘤內(nèi)Tregs數(shù)量；進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)顯示，肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理巨噬細(xì)胞刺激CD4+T細(xì)胞分化為Tregs。Wu等[13]發(fā)現(xiàn)，TREM-1+TAMs能通過上調(diào)CCL20表達(dá)水平，招募CCR6+Tregs在肝癌組織的聚集。

綜上，TAM通過直接分泌或細(xì)胞表面的免疫抑制因子以及招募免疫抑制性細(xì)胞Tregs，為肝癌發(fā)生、發(fā)展提供免疫耐受的微環(huán)境。

(二)促進(jìn)肝癌的血管生成

巨噬細(xì)胞是調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的關(guān)鍵參與者，能分泌大量促血管生成因子和調(diào)節(jié)血管生成的酶類刺激腫瘤血管的新生[18]。Bartneck等[19]發(fā)現(xiàn)，CCR2+ TAM聚集在肝癌腫瘤新生血管的周圍。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，抑制巨噬細(xì)胞在肝癌組織的募集能夠顯著降低瘤內(nèi)的血管密度并抑制腫瘤生長(zhǎng)。Zang等[20]發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)HCC患者外周血中IL-23的濃度顯著高于正常人。進(jìn)一步研究表明，HBV抗原能夠刺激肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌IL-23，同時(shí)，IL-23以自分泌方式通過JAK-STAT3信號(hào)通路上調(diào)VEGF-A等多個(gè)促血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的生成，而阻斷IL-23作用，能抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌的發(fā)展。

(三)促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

肝臟損傷能刺激巨噬細(xì)胞NADPH氧化酶(NOX)的表達(dá)和活化，產(chǎn)生大量活性氧，誘導(dǎo)基因突變，同時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)分泌多種因子促進(jìn)存活的肝細(xì)胞進(jìn)行代償性增殖，使得突變不斷累積。Liang等[21]利用DEN誘導(dǎo)小鼠原發(fā)性肝癌研究發(fā)現(xiàn)，條件性敲除巨噬細(xì)胞NOX4基因后，Nox1ΔMac小鼠肝癌腫瘤數(shù)量和大小顯著低于野生型。機(jī)制研究表明，NOX4是巨噬細(xì)胞調(diào)控肝細(xì)胞壞死誘導(dǎo)的炎癥響應(yīng)和肝細(xì)胞補(bǔ)償性增殖的關(guān)鍵基因；臨床實(shí)驗(yàn)也顯示，HCC患者腫瘤組織內(nèi)NOX4在TAM表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。

研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織內(nèi)的TAMs分泌的IL-6、IL-8[22]、TGF-β、EGF、 MMP-2和 MMP-9等能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，并提高其侵襲轉(zhuǎn)移能力[23]。HCC患者外周血IL-6濃度顯著高于正常人，而且與HCC性別差異、慢性肝炎的癌變以及HCC的不良預(yù)后密切相關(guān)[24]。Jiang等[25]發(fā)現(xiàn)，TMAs分泌的IL-6在缺氧條件下能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。

綜上，TAMs能通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)基因突變、分泌細(xì)胞因子或酶等促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移，從而提高肝癌細(xì)胞的惡性程度。

(四) 提高肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受性

巨噬細(xì)胞在靶向藥物耐藥中的重要性也受到越來越多的重視。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)，清除肝癌組織中巨噬細(xì)胞后能顯著增強(qiáng)索拉非尼的治療效果，使得原位腫瘤縮小及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移減少。近來，Dong等[27]發(fā)現(xiàn)， M2型巨噬細(xì)胞通過大量分泌HGF拮抗索拉非尼對(duì)ERK1/2/MAPK信號(hào)通路的抑制效果，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Fu等[28]發(fā)現(xiàn)，HCC患者腫瘤組織內(nèi)TAMs密度與奧沙利鉑治療耐藥程度呈正相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，TAMs能激活肝癌腫瘤細(xì)胞的自噬作用，提高對(duì)奧沙利鉑耐受性。

綜上，肝癌腫瘤組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞分泌的產(chǎn)物通過活化靶向藥物作用的信號(hào)通路或激活腫瘤細(xì)胞自噬作用，從而抑制靶向藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷或抑制。

三、靶向TAM的肝癌治療方案

目前，靶向TAMs的治療方案包括抑制單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞招募、清除腫瘤組織已有TAMs、誘導(dǎo)TAMs功能表型轉(zhuǎn)化和中和TAMs分泌的促腫瘤因子(表1)。

表1 靶向TAM的肝癌治療方案

(一)抑制單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞招募

CCL2/CCR2是調(diào)控實(shí)體腫瘤單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞招募的關(guān)鍵通路[29]。研究發(fā)現(xiàn)，CCL2在HCC腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)并與HCC不良預(yù)后有關(guān)，阻斷CCL2/CCR2信號(hào)通路可以阻斷肝癌單核細(xì)胞的募集和TAM的M2極化。Wang課題組將CCR2拮抗劑注射到原位肝癌模型小鼠腹腔后發(fā)現(xiàn)，肝癌瘤內(nèi)TAMs數(shù)量顯著減少，而CD8+T細(xì)胞大幅增多，顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)[30-31]。Teng等[32]發(fā)現(xiàn),CCL2單抗能抑制CD11bhighGr1+單核細(xì)胞在肝臟內(nèi)的積累以及腫瘤細(xì)胞在肝癌模型小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。

(二)清除肝癌組織中的TAMs

肝癌組織中巨噬細(xì)胞的密度與腫瘤大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況、TNM分級(jí)以及不良預(yù)后(如生存期、耐藥性)密切相關(guān)。Zhang 等[26]發(fā)現(xiàn)，通過唑來膦酸或脂質(zhì)體(負(fù)載氯磷酸鹽)清除小鼠肝癌組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞，能顯著增強(qiáng)索拉非尼的治療效果，使得原位腫瘤縮小及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移減少。Zhou等[33]發(fā)現(xiàn)，與肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)相比，聯(lián)合靶向清除巨噬細(xì)胞的治療方案能持續(xù)抑制肝癌腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤血管的新生。

(三)誘導(dǎo)TAM功能表型的轉(zhuǎn)化

隨著腫瘤發(fā)生、發(fā)展，TAM從早期抗癌的M1型巨噬細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)化為促癌的M2型巨噬細(xì)胞。Sprinzl等[34]發(fā)現(xiàn)，化療藥物索拉非尼能改變巨噬細(xì)胞的功能表型，抑制生長(zhǎng)因子IGF-1的分泌，控制M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Tan等[35]發(fā)現(xiàn)，天然黃酮化合物黃芩苷能特異性地誘導(dǎo)小鼠肝癌組織內(nèi)MR+M2型巨噬細(xì)胞極化為iNOS+M1型，從而抑制小鼠肝癌的生長(zhǎng)。

四、小結(jié)

TAMs是HCC腫瘤組織數(shù)量最多的免疫細(xì)胞，通過釋放大量活性氧、活性氮、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和基質(zhì)蛋白酶等，為腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、免疫逃逸以及侵襲轉(zhuǎn)移提供了有利條件，因此，其數(shù)量和功能表型常與HCC臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，TAMs也成為HCC免疫治療的重要靶標(biāo)。目前，靶向巨噬細(xì)胞治療肝癌的研究方向主要包括抑制單核細(xì)胞的募集、清除已有的TAMs、誘導(dǎo)TAMs再分化等。期望通過這些方法控制TAMs在肝癌組織的數(shù)量或恢復(fù)其腫瘤免疫監(jiān)視的功能作用，從而抑制肝癌的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移以及血管新生。