儲(chǔ)曉婷，謝承佳，唐蘇蘇，江 凌，徐 嫻

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211800；2.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；3.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800；4.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；5.南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210046)

紫色桿菌素(violacein)是由微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要由革蘭氏陰性菌生產(chǎn)，在乙醇、丙酮和甲醇等有機(jī)溶劑中具有較高的溶解度，并且在輕金屬離子和氧化劑(如H2O2)的條件下具有良好的穩(wěn)定性[1]。紫色桿菌素具有多種生物活性：它可使腫瘤細(xì)胞的核酸物質(zhì)在結(jié)構(gòu)形態(tài)上發(fā)生改變，對(duì)白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞等具有很強(qiáng)的抑制效果[2]；它通過提高線粒體的膜電位使人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5細(xì)胞)和子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系(HeLa細(xì)胞)凋亡[3]。在抗菌方面，紫色桿菌素能抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，對(duì)芽孢桿菌(Bacillussp.)、金黃色葡萄球菌(Staploylococcousaureus)、分枝桿菌(Mycobacterium)及鏈球菌(Streptococcussp.)等革蘭氏陽性菌有明顯的抗菌活性，而對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性則相對(duì)較低[4-8]。紫色桿菌素具有較強(qiáng)的抗氧化性，與β-環(huán)糊精以1∶2的比例形成的絡(luò)合物可進(jìn)一步增強(qiáng)紫色桿菌素的抗氧化活性，從而有效防止肝細(xì)胞過氧化損傷[9]。這些特性使得紫色桿菌素在食品、生物醫(yī)藥和印染工業(yè)等領(lǐng)域[10-12]具有廣闊的應(yīng)用前景。

紫色桿菌素的生物合成途徑最先由Pemberton等[13]提出，并由Balibar等[14]完全闡明。該途徑由2個(gè)色氨酸分子經(jīng)過由1個(gè)基因簇編碼的5種酶蛋白催化質(zhì)氧化縮合而成[15]。在自然界中，產(chǎn)紫色桿菌素的菌株主要包括Chromobacteriumviolaceum[16]、Janthinobacteriumlividum[17]、Pseudoalteromonasluteoviolacea[18]、Duganellasp.[19]和Janthinobacteriumsp.B9-8[20]等，它們可以從海洋、冰川、河流和土壤等環(huán)境中篩選獲得，具有獨(dú)特的生存能力[19,21]。雖然這些微生物能夠產(chǎn)生紫色桿菌素，但是由于它們存在產(chǎn)物生成速率低、前體物質(zhì)供應(yīng)不足以及一些菌株具有致病性等不利因素，特別是紫色桿菌素在這些原始菌株中產(chǎn)量并不高，因此以這些菌株規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)紫色桿菌素受到限制。

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，基于代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)尋找新策略來提高紫色桿菌素的生產(chǎn)規(guī)模和擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域成為目前研究的熱點(diǎn)。同時(shí)，研究者們開始尋找新的微生物，鑒定新的基因簇，構(gòu)建基因工程菌，以不同底盤細(xì)胞異源生產(chǎn)紫色桿菌素，為紫色桿菌素的大規(guī)模生產(chǎn)提供新思路。

1 紫色桿菌素合成基因簇的多樣性

在不同微生物中，由于基因(簇)的不同，會(huì)影響所合成的紫色桿菌素及其衍生物結(jié)構(gòu)、產(chǎn)量等。目前，愈來愈多的紫色桿菌素產(chǎn)生菌被發(fā)現(xiàn)，其中部分菌株完成了基因組測(cè)序工作，已收錄在NCBI數(shù)據(jù)庫中(表1)。這些基因組數(shù)據(jù)為分析紫色桿菌素合成的相關(guān)基因(簇)，研究基因結(jié)構(gòu)及在染色體上的分布規(guī)律，進(jìn)一步解析紫色桿菌素的合成機(jī)制、基因調(diào)控模式及其產(chǎn)生微生物和基因的多樣性研究提供了基礎(chǔ)。

表1 全基因組測(cè)序的產(chǎn)紫色桿菌素菌株Table 1 Original strains of violacein-producing by whole genome sequencing

紫色桿菌素的生物合成共涉及6步反應(yīng)，由5步酶促反應(yīng)和一步非酶促氧化脫羧反應(yīng)組成[26]，這是由一個(gè)基因簇控制的多基因調(diào)控合成過程，具體的反應(yīng)過程相對(duì)復(fù)雜。通過解析上述已測(cè)序的基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，控制紫色桿菌素合成的基因簇(vioABCDE)由vioA、vioB、vioC、vioD和vioE這5個(gè)基因組成，且它們?cè)谕环较蛏线M(jìn)行轉(zhuǎn)錄。L-色氨酸氧化酶(VioA，由vioA基因編碼)在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)存在時(shí)，將L-色氨酸氧化脫氨生成吲哚-3-丙酮酸(IPA)；IPA在聚酮合成酶(VioB，由vioB基因編碼)的作用下合成IPA亞胺二聚體(CAP)；VioE酶(由vioE基因編碼)以CAP作為底物生成脫氧紫色桿菌素前體；脫氧紫色桿菌素前體在色氨酸羥化酶(VioD，由vioD基因編碼)的羥化作用下生成紫色桿菌素前體(proviolacein)，最后在單加氧酶(VioC，由vioC基因編碼)的氧化作用下生成紫色桿菌素。同時(shí)，VioC酶在NAD(P)H的條件下還會(huì)對(duì)脫氧紫色桿菌素前體起催化作用，產(chǎn)生紫色桿菌素衍生物——脫氧紫色桿菌素。當(dāng)微生物缺失VioC時(shí)，會(huì)產(chǎn)生其他衍生物，如deoxychromoviridans、chromoviridans、oxychromoviridans等[21]。

紫色桿菌素合成基因簇的多樣性體現(xiàn)在：①基因簇及其調(diào)控序列在基因組上的有無；②不同來源的基因簇序列有一定的差異；③5個(gè)組成基因及其調(diào)控元件的不同組合方式導(dǎo)致產(chǎn)物的多樣化和含量的差異。

Kumar等[27]從錫金喜馬拉雅冰川的溪水中分離到1株淺粉紅色細(xì)菌JanthinobacteriumlividumERGS5∶01，它不產(chǎn)生該屬典型的紫羅蘭色素，且在基因組中也沒有發(fā)現(xiàn)紫羅蘭素的合成基因簇(vioABCDE)。Gong等[28]篩選獲得的菌株Janthinobacteriumpsychrotoleranssp.nov.具有明顯區(qū)別于該屬其他菌株的特征，雖然它與該屬的其他菌株具有99%的16S rRNA序列同源性，但經(jīng)基因組測(cè)序注釋后發(fā)現(xiàn)該菌也缺乏紫色桿菌素合成基因簇，所以該菌株在平板上呈現(xiàn)淡黃色。O’Brien等[29]對(duì)1株鮮紅色菌株Janthinobacteriumsp.BJB412基因組測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素合成基因簇缺失的情況。從南極冰川河流中分離獲得的菌株Janthinobacteriumsp.strain CG3也不產(chǎn)生紫色桿菌素，因?yàn)樵谄浠蚪M上不存在紫色桿菌素合成的關(guān)鍵操縱子vioA[30]。

不同來源紫色桿菌素基因簇雖然都是由5個(gè)基因組成，但在基因的組成上具有一定的差異。如，從新疆低溫污水中篩選獲得的菌株Janthinobacteriumsp.B9-8，它的紫色桿菌素合成基因簇與其他菌株的同源性不高(64%～78%)，尤其是與產(chǎn)紫色桿菌素的常用菌株C.violaceum和J.lividum相比，相應(yīng)的基因同源性較低，僅為64%和66%[20]。Zhang等[31]鑒定了Pseudoalteromonassp.520P1中紫色桿菌素合成的基因簇，經(jīng)多序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，它與P.tunicataD2具有較高的同源性，而與其他紫色桿菌素產(chǎn)生菌(C.violaceum、J.lividum和Duganellasp.B2)的同源性較低，其中基因簇的上游調(diào)控序列與P.tunicataD2的同源性僅為57.3%，而與C.violaceum的同源性只有29.4%，在同一基因水平上顯示出明顯的差異。來源于Duganellasp.B2的紫色桿菌素基因簇則與C.violaceum中的同源性僅65.4%，與J.lividum中的基因簇同源性為83.1%，并且在不同宿主中的產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)組成也不同[32]。新發(fā)現(xiàn)的菌株D.violaceinigrastr.NI28與D.violaceinigraYIM 31327在16S RNA序列上具有98.8%的同源性，但是其vioA基因卻只有88.8%的同源性，雖然這表明NI28與YIM 31327親緣上比較接近，但是這兩株菌仍具有一定的差異[33]。

紫色桿菌素的產(chǎn)量及在粗提色素中的含量組成與所采用的質(zhì)粒和表達(dá)宿主密切相關(guān)。如，將來源于Duganellasp.B2的紫色桿菌素基因簇在C.freundii和E.aerogenes中分別表達(dá)時(shí)，紫色桿菌素在總色素中的含量變少，不及其原始菌中的含量比例；當(dāng)使用pET32作為表達(dá)載體時(shí)，不產(chǎn)生紫色桿菌素而產(chǎn)生它的衍生物——脫氧紫色桿菌素，而用pET17b為載體，則能產(chǎn)生大量的紫色桿菌素[32]。Lee等[34]利用紫色桿菌素合成基因簇構(gòu)建了1個(gè)3 125個(gè)組合的文庫，將其在酵母中表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，不同的基因組合則最終的產(chǎn)物不同，他們檢測(cè)到了4種主要產(chǎn)物(紫色桿菌素、脫氧紫色桿菌素和它們相對(duì)應(yīng)的前體)外，還有少量的一些其他衍生物(如chromoviridans和oxychromoviridans)。Rodrigues等[35]將來源于C.violaceum的vioABCE基因構(gòu)建了菌株dVio-1，它能夠產(chǎn)生180 mg/L脫氧紫色桿菌素；之后在基因組上整合來源于J.lividum的vioD基因，獲得的菌株Vio-4可生產(chǎn)710 mg/L的紫色桿菌素。Segall-Shapiro等[36]設(shè)計(jì)穩(wěn)定型啟動(dòng)子TALEsp2，將其與不同核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)以及vioA、vioB和vioC這3個(gè)基因進(jìn)行組合，再分別構(gòu)建質(zhì)粒、整合到基因組上用來合成紫色桿菌素的衍生物——deoxychromoviridans，并根據(jù)產(chǎn)物顏色的不同來分析不同調(diào)控元件對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。

將不同來源的紫色桿菌素合成基因簇與其他種屬菌株中相應(yīng)的基因進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。由此可見，這些不同菌株中的基因簇同源性并不高(64.79%～78.54%)，在親緣關(guān)系上，以Chromobacterium屬、Pseudoalteromonas屬、Janthinobacterium屬和Duganellas屬這4個(gè)簇群存在，由此說明紫色桿菌素合成基因簇存在一定的多樣性。雖然目前已發(fā)現(xiàn)了一些能夠生產(chǎn)紫色桿菌素的微生物，然而這些野生型菌株在培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的過程中會(huì)以較高頻率形成突變體，并且部分菌株具有潛在的致病性。除此之外，微生物體內(nèi)合成紫色桿菌素的機(jī)制比較復(fù)雜，涉及多個(gè)酶催化反應(yīng)，相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)以及多個(gè)催化步驟還有待進(jìn)一步挖掘及研究。

圖1 不同來源的紫色桿菌素合成基因簇系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of violacein biosynthesis gene cluster from different strains

在現(xiàn)有紫色桿菌素生產(chǎn)菌株基礎(chǔ)上，擴(kuò)充其他來源的菌株資源，發(fā)掘具有獨(dú)特功能或特性的基因，將較好特性的紫色桿菌素基因進(jìn)行異源表達(dá)，可以獲得新的菌株或基因資源，并進(jìn)一步獲得具有較高生產(chǎn)能力的微生物菌株，促進(jìn)紫色桿菌素的工業(yè)化生產(chǎn)，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2 產(chǎn)紫色桿菌素基因工程菌的構(gòu)建

為了解決原始菌株產(chǎn)量低、產(chǎn)品純度低的問題，可將紫色桿菌素基因簇導(dǎo)入其他宿主中進(jìn)行異源表達(dá)。進(jìn)行異源表達(dá)時(shí)，宿主的選擇是關(guān)鍵，因?yàn)樽仙珬U菌素作為抗生素對(duì)革蘭氏陽性菌具有殺菌作用，而且不同的宿主對(duì)于該基因簇的表達(dá)和調(diào)控存在差異。在一些常用表達(dá)宿主中表達(dá)這些基因(簇)，可實(shí)現(xiàn)定向快速合成紫色桿菌素，增加其產(chǎn)量，更有助于解析紫色桿菌素生產(chǎn)中涉及的關(guān)鍵代謝途徑。

2.1 產(chǎn)紫色桿菌素大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建

大腸桿菌具有生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)方便、生長(zhǎng)要求低、基因工程操作方便、代謝途徑清晰、合成調(diào)控較為簡(jiǎn)單和可行等優(yōu)點(diǎn)，因此在大腸桿菌中人工構(gòu)建紫色桿菌素合成途徑方面的研究成果較多。Pemberton等[13]在1991年將來自C.violaceum的紫色桿菌素合成基因使用粘粒pHC79連接到轉(zhuǎn)座子Tn5的BamHⅠ位點(diǎn)上，形成載體pHC79ΔBamHⅠ::Tn5，將構(gòu)建成功的載體導(dǎo)入大腸桿菌MM294后成功表達(dá)，這是紫色桿菌素基因簇vioABCDE異源表達(dá)的最早實(shí)例。Fang等[37]將來源于Citrobacterfreundii的紫色桿菌素基因簇通過質(zhì)粒pACYCDuet-trpE fbr/trpD(pED)和pRSFDuet-vio(pVio)共轉(zhuǎn)化到具有不同色氨酸生產(chǎn)能力的菌株B1～B8中，共產(chǎn)生了8個(gè)工程菌株，其中，大腸桿菌B2/pED + pVio產(chǎn)紫色桿菌素產(chǎn)量最高，搖瓶產(chǎn)量為(600±10) mg/L。為了確定紫色桿菌素合成途徑的限速步驟，進(jìn)一步分別過表達(dá)紫色桿菌素通路中的vioA～vioE這5個(gè)基因后發(fā)現(xiàn)，菌株B8/pTRPH1-pVio-VioA和B8/pTRPH1-pVio-VioE的紫色桿菌素生產(chǎn)能力分別提高了14%和29%，從而確定了VioE酶是紫色桿菌素合成途徑的關(guān)鍵酶。最終vioE基因過表達(dá)的菌株B8/pTRPH1-pVio-VioE在5 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵得到產(chǎn)量為98.7 mg/L的紫色桿菌素[38]。Zhang等[31]克隆并表征了Pseudoalteromonassp.520P1的紫色桿菌素基因簇，將基因簇以及上、下游區(qū)域的完整序列克隆到載體pET28a中，在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了基因簇的成功表達(dá)，并產(chǎn)生了紫色桿菌素。為了實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌K12 DH5α中穩(wěn)定克隆以及高水平表達(dá)紫色桿菌素基因簇，Ahmetagic等[39]和Sarovich 等[40]在大腸桿菌K12 DH5α中使用Packagene?LambdaDNA包裝系統(tǒng)構(gòu)建放線菌Lechevalieiaraerocolonigenes的pPSX粘粒克隆庫，分別構(gòu)建質(zhì)粒pPSX-vioABCDE和pUC18-vioABCDE，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12 DH5α和K12 LE392中，在PYEA培養(yǎng)基中以及35 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：含pPSX-vioABCDE的大腸桿菌K12 DH5α和K12 LE392中的質(zhì)粒穩(wěn)定但紫色桿菌素水平低；含pUC18-vioABCDE的大腸桿菌K12 DH5α和K12 LE392能夠合成較高水平的紫色桿菌素，但重組菌株卻極不穩(wěn)定。Bilsland等[41]將來源于J.lividum的vioABCDE以及將vioD敲除后的vioABCE操縱子克隆至質(zhì)粒pBAT4上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中分別實(shí)現(xiàn)紫色桿菌素和脫氧紫色桿菌素的生產(chǎn)。

由此可見，為了快速鑒定紫色桿菌素的基因簇及各個(gè)基因功能，以大腸桿菌作為表達(dá)宿主進(jìn)行遺傳操作是最為簡(jiǎn)便的，但從生物安全性、前體氨基酸的供應(yīng)以及產(chǎn)物大量生產(chǎn)等方面綜合考慮，大腸桿菌未必是最合適的宿主，因此，也有構(gòu)建其他原核基因工程菌作為紫色桿菌素生產(chǎn)宿主的相關(guān)研究。

2.2 其他產(chǎn)紫色桿菌素原核基因工程菌的構(gòu)建

谷氨酸棒狀桿菌是安全的(GRAS)革蘭氏陽性菌，作為經(jīng)典氨基酸的產(chǎn)生菌具有色氨酸產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)，因此研究者們也將谷氨酸棒狀桿菌用作生產(chǎn)紫色桿菌素的代謝工程底盤。Sun等[42]分別從菌株J.lividum和C.violaceum克隆對(duì)應(yīng)基因簇vioABCDE，經(jīng)PCR擴(kuò)增后與質(zhì)粒pEC-XK99E連接分別構(gòu)建載體pEC-J-vio1和pEC-C-vio1，將重組載體通過電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒狀桿菌ATCC 21850中培養(yǎng)，重組菌株ATCC 21850(pEC-J-vio1)在接種培養(yǎng)12 h時(shí)加入0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，最終產(chǎn)生629 mg/L紫色桿菌素，而菌株ATCC 21850(pEC-C-vio1)的紫色桿菌素產(chǎn)量則達(dá)到1 116 mg/L。Jiang等[26]以Duganallasp.B2為vio基因簇的來源，選擇具有來自烷烴單加氧酶的Palkb強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCOM10作為載體，將vio基因簇與質(zhì)粒pCOM10連接構(gòu)建了重組載體pCOM10vio，采用電轉(zhuǎn)化法將重組載體分別導(dǎo)入檸檬酸桿菌C.freundii和惡臭假單胞菌P.putida，構(gòu)建成功的基因工程菌生產(chǎn)紫色桿菌素的產(chǎn)量分別達(dá)到了514 mg/L和1 620 mg/L。Domrose等[43]在P.putida中建立了可實(shí)現(xiàn)基因簇一步重組克隆的yTREX載體系統(tǒng)，將來自C.violaceumATCC 12472的紫色桿菌素vio基因簇整合到y(tǒng)TREX載體中，將重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1后，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到P.putidaKT2440中，于LB培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)，紫色桿菌素最高產(chǎn)量達(dá)到105 mg/L。Choi等[44]利用供體質(zhì)粒pTetSac-ΔpvdD::*將來源于C.violaceum的紫色桿菌素生物合成基因整合到P.putida染色體的靶遺傳基因座中，重組P.putida菌株在含有適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基中于30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，可以得到紫色桿菌素。

以上研究表明，不同來源的基因簇在不同原核表達(dá)宿主中獲得了不同產(chǎn)量的紫色桿菌素和其衍生物，但其生物合成在一定程度上并不穩(wěn)定[32]。基因工程菌的構(gòu)建，除了針對(duì)功能基因或者基因簇的鑒定篩選，表達(dá)質(zhì)粒與宿主的匹配性也至關(guān)重要。因此，適合紫色桿菌素的基因異源表達(dá)宿主還需進(jìn)一步探索。

2.3 產(chǎn)紫色桿菌素酵母基因工程菌的構(gòu)建

作為真核生物的典型代表，酵母菌也是一個(gè)常用的工程菌宿主?，F(xiàn)在酵母菌可合成一些難以合成的天然產(chǎn)物(如，烯萜類和抗細(xì)菌類產(chǎn)物)和多基因參與合成的復(fù)雜次級(jí)代謝產(chǎn)物。紫色桿菌素的多基因合成途徑也同樣被引入酵母菌中，Lee等[34]將vioABCDE基因簇與釀酒酵母載體pRS316進(jìn)行Gibson重組裝，將構(gòu)建完成的載體導(dǎo)入釀酒酵母菌株BY4741培養(yǎng)后，工程菌產(chǎn)生了紫色桿菌素、脫氧紫色桿菌素以及它們各自的前體物質(zhì)，表明vioABCDE基因簇可在釀酒酵母中成功表達(dá)。Zhou等[45]將酵母中的一種組裝策略工作流程(MiYA)應(yīng)用到釀酒酵母的紫色桿菌素合成途徑的構(gòu)建之中，產(chǎn)生了24個(gè)菌株，之后設(shè)計(jì)了3 125個(gè)組合的文庫后，在其中篩選獲得了比較純的紫色桿菌素產(chǎn)生菌株，最終含量提高了2.42倍[45]。Wong等[46]在解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)中開發(fā)了一種完整且通用的遺傳工具包YaliBrick，可簡(jiǎn)化多基因重復(fù)克隆步驟，并擴(kuò)增了來源于C.violaceum的vioA～vioEDNA片段，與質(zhì)粒pYaliA1進(jìn)行Gibson重組裝，利用YaliBrick方法進(jìn)行多次組裝克隆后獲得pYaliA1-vioDCBAE，轉(zhuǎn)入Y.lipolyticaP01gΔleu中，在30 ℃培養(yǎng)48 h后形成深紫色的酵母菌落，證明了紫色桿菌素途徑在解脂耶氏酵母中的成功構(gòu)建及表達(dá)。除此之外，研究者們也開發(fā)出其他的模塊化和層次化的多基因組裝方法(如，VEGAS、yGG等)在酵母中實(shí)現(xiàn)了紫色桿菌素的合成，通過菌體本身在平板上呈現(xiàn)顏色的不同就可挑選出所需要的高產(chǎn)菌株[47-48]。

目前大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、檸檬酸桿菌、惡臭假單胞菌和酵母菌等已被用作天然紫色桿菌素的異源合成宿主，實(shí)現(xiàn)了紫色桿菌素的定向生產(chǎn)。由此可見，紫色桿菌素工程菌中質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化模式主要通過3種方式：①紫色桿菌素基因簇直接克隆至單個(gè)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入宿主中；②紫色桿菌素基因簇以及與紫色桿菌素合成相關(guān)基因(如色氨酸合成基因)分別克隆至2個(gè)質(zhì)粒，2個(gè)質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入同一宿主中；③紫色桿菌素基因簇以及這5個(gè)基因中的vioX(vioA～vioE)克隆至同一個(gè)質(zhì)粒，在合成紫色桿菌素的同時(shí)增強(qiáng)5個(gè)基因中的一個(gè)或幾個(gè)的表達(dá)。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、載體系統(tǒng)成熟、重組子穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)使其成為紫色桿菌素異源生產(chǎn)的理想宿主菌，但是所構(gòu)建的重組菌產(chǎn)量普遍較低。谷氨酸棒狀桿菌和惡臭假單胞菌比大腸桿菌更利于紫色桿菌素的生物合成，特別是谷氨酸棒狀桿菌作為安全的基因工程宿主菌，具有較強(qiáng)的色氨酸生產(chǎn)能力，在紫色桿菌素的異源表達(dá)和定向合成中具有巨大優(yōu)勢(shì)。但是，紫色桿菌素工程菌的生物合成能力仍需進(jìn)一步提高，如何實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量工程菌株的制備，還有待更深入的研究。

3 紫色桿菌素基因工程菌生產(chǎn)途徑的調(diào)控機(jī)制

將紫色桿菌素合成途徑導(dǎo)入宿主菌之后，還需對(duì)微生物中紫色桿菌素合成途徑進(jìn)行調(diào)控優(yōu)化，以提高紫色桿菌素的產(chǎn)量和合成效率，主要包括菌株群體感應(yīng)機(jī)制的調(diào)節(jié)、操縱子與基因順序、色氨酸前體供給、相關(guān)基因突變和發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化等。

3.1 群體感應(yīng)機(jī)制對(duì)基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)

群體感應(yīng)機(jī)制(QS)是由脂肪酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)作為細(xì)胞外群體感應(yīng)信號(hào)，通過激活A(yù)HL受體蛋白LuxR調(diào)節(jié)群體密度依賴性基因的表達(dá)。QS系統(tǒng)由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CviI和CviR組成，受細(xì)胞密度的調(diào)控。通過增加細(xì)胞密度，可促進(jìn)AHL的產(chǎn)生并累積，累積的AHL與受體蛋白結(jié)合形成復(fù)合物后，與紫色桿菌素生物合成操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點(diǎn)相互作用單向觸發(fā)vio操縱子的表達(dá)，從而促進(jìn)紫色桿菌素的產(chǎn)生(圖2通路①)[49]。Aye等[50]證實(shí)菌株P(guān)seudoalteromonasulvaeTC14具有明顯的群體感應(yīng)特征，通過誘導(dǎo)AHL可激發(fā)菌株中紫色桿菌素的產(chǎn)生。在C.violaceum中，紫色桿菌素的合成受到細(xì)菌群體感應(yīng)的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)模式的改變及結(jié)果可由色素直觀顯示，因此C.violaceum菌作為生物傳感器被廣泛用于QS研究[51]。在野生型C.violaceum中產(chǎn)生的N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯(C6HSL)作為其主要的AHL，Blosser等[52]將含有來自Photorhabdusluminescens的發(fā)光基因和來自費(fèi)氏弧菌的自誘導(dǎo)劑受體基因(luxR)的重組質(zhì)粒pSB403轉(zhuǎn)入C.violaceumCV0blu菌株培養(yǎng)作為AHL自誘導(dǎo)物的來源，將發(fā)酵液進(jìn)行濃縮萃取后，測(cè)定其中的C6HSL，證明重組菌C.violaceumCV0blu(pSB403)中具有多種短鏈C6HSL的存在，不同劑量的C6HSL和紫色桿菌素含量呈線性相關(guān)關(guān)系，當(dāng)C6HSL濃度為20 nmol/L時(shí)，紫色桿菌素含量達(dá)到飽和。這表明，C.violaceumCV0blu(pSB403)合成的紫色桿菌素在C6HSL的誘導(dǎo)下產(chǎn)生，與C6HSL濃度直接相關(guān)。

①cviI編碼合成AHL合酶觸發(fā)vio操縱子的表達(dá)；②J. lividum原始 vio操縱子序列被具有擴(kuò)展的完整RBS序列替代以及vio操縱子基因順序改變；③叉號(hào)表示要敲除的與色氨酸積累途徑有關(guān)的基因；④vio基因及調(diào)控基因的突變。G6P—葡萄糖-6-磷酸；FDP—果糖-1,6-二磷酸；DHAP—磷酸二羥基丙酮；G3P—甘油醛3-磷酸；PEP—磷酸烯醇丙酮酸；PYR—丙酮酸；AcCoA—乙酰輔酶A；CIT—檸檬酸；MAL—蘋果酸；OAA—草酰乙酸；E4P—4-磷酸赤蘚糖丙酮酸；DS—3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶 ；DAHP—3-脫氧-D-5可拉伯庚酮糖-7-磷酸；CM—分支酸變位酶；CA—鳥叉酸;Trp—色氨酸圖2 紫色桿菌素的生物合成途徑和與生產(chǎn)途徑調(diào)控有關(guān)的基因操作Fig.2 Biosynthetic pathway of violacein and the genetic manipulations related to the regulatory pathway of violacein

3.2 vio操縱子與基因順序?qū)ψ仙珬U菌素合成基因表達(dá)的影響

通過改變基因操縱子元件以及基因順序可以對(duì)紫色桿菌素的產(chǎn)量進(jìn)行調(diào)控。Sun等[42]發(fā)現(xiàn)J.lividum中的vio操縱子具有重疊基因，這種操縱子結(jié)構(gòu)有可能會(huì)阻礙vio基因的異源表達(dá)，為了驗(yàn)證這一假設(shè)，將重疊基因分開表達(dá)，并引入了谷氨酸棒桿菌RBS序列(GAAAGGAGGTTTGGACA)與vio基因重構(gòu)操縱子單元(圖2通路②)，將vioABCDE與質(zhì)粒pEC-XK99E構(gòu)建載體pEC-J-vio2轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌，結(jié)果重組谷氨酸棒桿菌ATCC 21850(pEC-J-vio2)的紫色桿菌素產(chǎn)量為815 mg/L，生物量為20 g/L，均高于未在基因之前添加谷氨酸棒桿菌RBS序列的菌株(629 mg/L和15 g/L)。為了研究基因順序是否影響谷氨酸棒桿菌中的紫色桿菌素產(chǎn)生，Sun等[42]按照vioB、vioA、vioE、vioC、vioD的先后順序構(gòu)建了與原始菌株中紫色桿菌素合成基因催化順序不同的新序列，與質(zhì)粒pEC-XK99E連接構(gòu)建質(zhì)粒pEC-C-vio2后發(fā)現(xiàn)，含有此重組子的谷氨酸棒桿菌的生物量和紫色桿菌素產(chǎn)量反而不如原先構(gòu)建的菌株。這證明了不同基因順序?qū)劝彼岚魲U菌內(nèi)的紫色桿菌素含量具有影響，不合適的基因順序反而降低了紫色桿菌素產(chǎn)量。Immanuel等[53]針對(duì)紫色桿菌素的5個(gè)基因設(shè)計(jì)了人工合成操縱子并利用計(jì)算模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，最后在不同大腸桿菌宿主中驗(yàn)證，最終獲得了33.8 mg/L的紫色桿菌素，與野生型操縱子相比產(chǎn)量提高了6倍。Geier等[54]利用1個(gè)2A多肽在酵母中構(gòu)建了1個(gè)9個(gè)基因表達(dá)的多順反子，實(shí)現(xiàn)了β-胡蘿卜素和紫色桿菌素的共同合成，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，多順反子結(jié)構(gòu)中基因的順序?qū)ν緩降暮铣尚视酗@著影響：當(dāng)把紫色桿菌素合成基因放在β-胡蘿卜素合成基因之前，培養(yǎng)60 h后的菌株已經(jīng)顯示出明顯的棕色表型(類胡蘿卜素和紫色桿菌素顏色疊加的效果)；如果反過來，將類胡蘿卜素基因放在前面，則需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到類似的結(jié)果。由此可見，操縱子的組成以及其不同順序的組合，對(duì)紫色桿菌素的合成具有一定的影響。

3.3 通過調(diào)控色氨酸前體供給途徑改變紫色桿菌素合成

增加紫色桿菌素合成的前體物質(zhì)色氨酸供應(yīng)，有助于在大腸桿菌細(xì)胞工廠中異源生產(chǎn)紫色桿菌素，調(diào)控分為兩方面：從基因水平上進(jìn)行改造和外源前體添加。在基因水平上，F(xiàn)ang等[37]通過敲除色氨酸合成途徑中的編碼色氨酸酶的tnaA基因、編碼酪氨酸酶和苯丙氨酸酶的pheA基因以及trpR基因和過表達(dá)關(guān)鍵基因TrpEfbr和TrpD，以產(chǎn)生具有不同色氨酸生產(chǎn)力的菌株B1～B8(圖2通路③)。隨后，將紫色桿菌素合成途徑的vio基因簇連接到載體pRSFDuet上后，轉(zhuǎn)入工程菌株B1～B8進(jìn)行培養(yǎng)，最終菌株B2產(chǎn)生紫色桿菌素產(chǎn)量最高，在搖瓶中產(chǎn)量為(600±10) mg/L，比未調(diào)控色氨酸合成途徑的對(duì)照菌株產(chǎn)量提高4倍。在5 L發(fā)酵罐中以葡萄糖作為碳源進(jìn)行分批發(fā)酵，產(chǎn)量達(dá)到1 750 mg/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到36 mg/(L·h)，這是目前在相同的培養(yǎng)條件下，不額外添加前體色氨酸的最高產(chǎn)量。為了提高色氨酸在細(xì)胞內(nèi)的利用率，Rodrigues等[35]敲除了色氨酸操縱子的阻遏子基因trpR、降解色氨酸的tnaA基因和參與絲氨酸降解的sdaA基因，消除與色氨酸和絲氨酸的降解有關(guān)途徑從而增加色氨酸的供給，所構(gòu)建的大腸桿菌dVio-2產(chǎn)色氨酸和絲氨酸水平分別增加了69.6%和21.0%，產(chǎn)生了202.8 mg/L的脫氧紫色桿菌素，在此基礎(chǔ)上引入vioD基因?qū)⒚撗踝仙珬U菌素轉(zhuǎn)化為紫色桿菌素，分批發(fā)酵最終獲得了700 mg/L的紫色桿菌素。

針對(duì)基因工程菌株進(jìn)行外源添加色氨酸的研究較少，Gwon等[55]構(gòu)建了能夠產(chǎn)生紫色桿菌素的重組大腸桿菌，并考察額外添加色氨酸對(duì)紫色桿菌素產(chǎn)生的影響。與不添加任何其他補(bǔ)充劑相比，添加0.1 g/L色氨酸時(shí)，紫色桿菌素的產(chǎn)量增加了1.23倍。He等[56]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加色氨酸可以提高具有較低紫色桿菌素產(chǎn)量的大腸桿菌工程菌的生產(chǎn)能力，但是卻對(duì)具有高產(chǎn)量的菌株有抑制作用。

因此，如何建立針對(duì)紫色桿菌素的生產(chǎn)過程進(jìn)行外源添加色氨酸底物的模式使得底物轉(zhuǎn)化率提高從而獲得高產(chǎn)量，還需要進(jìn)一步研究。

3.4 vio基因及調(diào)控基因的突變影響紫色桿菌素的合成

基因本身的突變或改變會(huì)導(dǎo)致所表達(dá)的蛋白發(fā)生變化，從而對(duì)紫色桿菌素的合成造成影響。Jiang等[57]將來源于Duganallasp.B2的vio基因簇構(gòu)建重組載體pCOM10Vio，采用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入C.freundiiL，作為出發(fā)菌株送入太空進(jìn)行誘發(fā)突變，經(jīng)過96孔板初篩后，再用三角板復(fù)篩，最終確定高產(chǎn)誘變菌，所篩選獲得的高產(chǎn)菌株紫色桿菌素產(chǎn)量比原始菌株產(chǎn)量提高了50%以上。提取原始菌株、高產(chǎn)菌株和低產(chǎn)菌株質(zhì)粒進(jìn)行紫色桿菌素生物合成基因簇序列分析后發(fā)現(xiàn)，3種菌株的質(zhì)粒大小以及基因簇完全相同，因此推測(cè)可能是由于染色體上其他位置的調(diào)控基因發(fā)生變化而導(dǎo)致了“適應(yīng)性突變”。Ahmetagic等[58]將來源于C.violaceum的基因簇vioABCDE克隆至質(zhì)粒形成pPSX-vioABCDE，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后發(fā)現(xiàn)，有少數(shù)菌株不僅大量產(chǎn)生紫色桿菌素，而且還保持了高穩(wěn)定性；對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在vioABCDE操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域中具有單堿基對(duì)缺失，形成突變質(zhì)粒pPSX-VioABCDE opv-1(圖2通路④)，最終重組菌的紫色桿菌素產(chǎn)量是含有未突變質(zhì)粒菌株的4倍。Englaender等[59]將編碼紫色桿菌素的基因vioB和vioC進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得突變體vioB*和vioC*(圖2通路④)，將含有突變體的基因簇vioABCDE與質(zhì)粒pETM6連接，通過多步克隆構(gòu)建載體pETM6-m-vioA-m-vioB*-m-vioE-m-vioC*-m-vioD和整合載體pTKDP-m-vioA-m-vioB*-m-vioE-m-vioC*-m-vioD；通過整合載體分別將紫色桿菌素基因簇整合到大腸桿菌染色體上的4個(gè)基因組基因座LacZ、AtpI-gidB、RecA和YbbD上，并測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RecA基因組位點(diǎn)所產(chǎn)生的整合導(dǎo)致突變重組體產(chǎn)生了紫色桿菌素。由此可見，通過基因突變，不僅是基因簇本身，而且還包括基因組上其他調(diào)控基因及轉(zhuǎn)座位點(diǎn)的突變都會(huì)對(duì)紫色桿菌素的合成途徑產(chǎn)生一定的影響。

3.5 菌株的培養(yǎng)條件對(duì)紫色桿菌素產(chǎn)量的影響

菌株的外部調(diào)控也是影響基因工程菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要因素，一些發(fā)酵條件也影響著紫色桿菌素的產(chǎn)量。為了檢測(cè)溶氧量(DO)和pH對(duì)重組菌株C.freundiipCOM10vio的細(xì)胞生長(zhǎng)和紫色桿菌素產(chǎn)量的影響，Yang等[60]將DO控制在≤5%、10%±5%、25%±5%和≥40%(空氣飽和度)的相對(duì)恒定值，且pH控制在5.0、6.0、7.0和8.0進(jìn)行重組菌的培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)DO約為25%時(shí)獲得紫色桿菌素產(chǎn)量超過900 mg/L；當(dāng)DO低于5%時(shí)，產(chǎn)量低于100 mg/L；當(dāng)pH控制在7.0時(shí)，紫色桿菌素濃度達(dá)到最高，且生產(chǎn)強(qiáng)度為30.6 mg/(L·h)；在更高或更低的pH下，紫色桿菌素產(chǎn)量和細(xì)胞生物量均降低。Sun等[42]對(duì)谷氨酸棒桿菌基因工程菌從溫度、培養(yǎng)時(shí)間及誘導(dǎo)劑等方面進(jìn)行條件優(yōu)化后找到最佳發(fā)酵條件，谷氨酸棒桿菌21850在20 ℃條件下發(fā)酵18 h，然后添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，得到2 344 mg/L的紫色桿菌素。Lee等[61]構(gòu)建了含有完整紫色桿菌素生物合成基因簇(vioABCDE)的重組大腸桿菌，通過3種不同培養(yǎng)基(LB、TB和TB添加色氨酸)、不同培養(yǎng)溫度(20、30和37 ℃)的比較，最終在含5 g/L色氨酸的TB培養(yǎng)基中，20 ℃發(fā)酵培養(yǎng)紫色桿菌素產(chǎn)量較高，為后續(xù)進(jìn)行糖基化修飾紫色桿菌素合成增加水溶性的葡萄糖苷衍生物奠定了基礎(chǔ)。

由于紫色桿菌素的產(chǎn)生菌大多是從較冷的環(huán)境中篩選獲得，因此對(duì)于紫色桿菌素的工程菌來說，溫度是一個(gè)重要的影響因素，除了溫度外，IPTG在異源蛋白表達(dá)中也起著重要作用，并影響宿主菌株的生產(chǎn)力。紫色桿菌素這種次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生往往是先滿足菌株的生長(zhǎng)再合成產(chǎn)物，因此發(fā)酵時(shí)間也是一個(gè)需要考慮的因素。通過這些條件的優(yōu)化，對(duì)紫色桿菌素的產(chǎn)生起到了一定的提高效果。

綜上所述，紫色桿菌素的產(chǎn)生除了受到自身基因簇的影響外，還涉及各種因素調(diào)控：通過敲除作為前體物質(zhì)的色氨酸合成途徑中的編碼色氨酸酶基因，可使紫色桿菌素工程菌生物合成能力在原始基礎(chǔ)上大幅度增強(qiáng)。而基因簇及關(guān)鍵基因的突變可對(duì)菌落形態(tài)以及蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生差異，從而影響紫色桿菌素的合成能力。目前針對(duì)紫色桿菌素工程菌的發(fā)酵條件因素的研究較為深入，通過確定最佳培養(yǎng)條件可以實(shí)現(xiàn)紫色桿菌素合成基因的高表達(dá)。這些調(diào)控模式在一定程度上實(shí)現(xiàn)了紫色桿菌素產(chǎn)量的優(yōu)化，我們將上述各種調(diào)控方式、產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度歸納在表2之中，希望能夠在將來開發(fā)出一些新的調(diào)控模式，摸索紫色桿菌素在多酶合成上的調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步提高其產(chǎn)量。

表2 不同基因工程菌株紫色桿菌素及衍生物產(chǎn)量Table 2 Yields of violacein and its derivatives from different genetically engineered strains

4 結(jié)論及展望

作為次級(jí)代謝產(chǎn)物的紫色桿菌素有多種生物活性，尤其是特有的抗癌和抗菌特性，近年來引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。天然產(chǎn)紫色桿菌素的菌株不僅種類豐富，而且在基因組上的基因簇也是呈現(xiàn)多樣化的特征。通過基因工程和合成生物學(xué)手段構(gòu)建基因工程菌株是現(xiàn)階段提高紫色桿菌素產(chǎn)量的有效手段。目前，已成功在大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、檸檬酸桿菌、惡臭假單胞菌和釀酒酵母等常用表達(dá)宿主中構(gòu)建了紫色桿菌素的合成途徑。針對(duì)這些基因工程菌株，從群體感應(yīng)機(jī)制、操縱子與基因順序、色氨酸前體供給、相關(guān)基因突變和外部培養(yǎng)條件等方面進(jìn)行調(diào)控會(huì)對(duì)紫色桿菌素的產(chǎn)量產(chǎn)生較大的影響。

紫色桿菌素的生物合成由5個(gè)基因組成的基因簇調(diào)控合成，由于其來源的多樣性和基因之間的差異性，存在多基因協(xié)同表達(dá)的復(fù)雜性和多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化的低效性的問題，因此在細(xì)胞和分子水平上的作用機(jī)制等仍需進(jìn)一步深入探索。迄今為止，針對(duì)紫色桿菌素的研究工作主要在國(guó)外展開，國(guó)內(nèi)針對(duì)其研究較少。同時(shí)，目前研究都集中在紫色桿菌素本身的合成、結(jié)構(gòu)和功能解析上，針對(duì)vio基因簇在多基因合成中所生成紫色桿菌素的副產(chǎn)物衍生物——脫氧紫色桿菌素和羥基紫色桿菌素等研究相對(duì)較少，它們的生物活性和合成調(diào)控機(jī)制尚不明確，這也是需要深入探索的研究方向。

未來，借助多基因和多酶協(xié)同催化技術(shù)，如無細(xì)胞表達(dá)體系、蛋白和DNA支架、DNA納米技術(shù)等，解析紫色桿菌素的多酶合成的協(xié)同機(jī)制，以解決多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)普遍存在的催化效率低等問題；同時(shí)結(jié)合多酶催化協(xié)同作用和基因簇的多樣性，拓展其合成范圍，有望能獲得具有新型結(jié)構(gòu)或功能的化合物，為紫色桿菌素的應(yīng)用和研究奠定基礎(chǔ)。