馬蘭花，顧亞榮，張永峰，潘和平，閻 萍 (1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730030)

牦牛生活在海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)，作為高原上寶貴的生物遺傳資源和財富，這是高原藏區(qū)的文化符號之一，具有極高的研究和開發(fā)價值[1]。牦牛在食物來源及種類匱乏、自然氣候條件惡劣的高海拔高原生態(tài)環(huán)境中表現(xiàn)出極強的適應性,利用牦牛這種生物特性開展牦牛遺傳資源保護與開發(fā)利用，對促進藏區(qū)經(jīng)濟價值和生態(tài)價值具有十分重要的發(fā)展意義[2]。青海省大通牦牛是通過傳統(tǒng)的雜交手段培育的首個肉用型牦牛新品種[3],擁有肉質(zhì)鮮美、高蛋白、低脂肪等特點[4-5],在長期自然選擇過程中,其脂肪發(fā)育脂質(zhì)沉積的調(diào)控在品種和組織中具有明顯的特異性[6],但牦牛生長緩慢,脂肪沉積效率低、嫩度差、口感粗糙，影響牦牛的肉用價值[7]。隨著生物技術的發(fā)展,從分子水平研究生物效應中的基礎作用關系,有利于運用遺傳學手段來改善生物表觀遺傳水平,使生物表型朝著生態(tài)/經(jīng)濟雙重價值的方向發(fā)展[8]。

N6-腺苷酸甲基(N6-methyladenosine,m6A)是RNA分子上特定腺嘌呤N6位置上的CH3基團，是真核生物中最常見的一種動態(tài)可逆的轉(zhuǎn)錄后修飾。甲基化酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14,METTL14)作為m6A甲基化過程中底物結(jié)合平臺,與甲基化酶樣蛋白3(methyltransferase-like protein 3,METTL3)形成穩(wěn)定的復合物[9],激活并增強METTL3的催化活性。復合物被腎母細胞瘤1相關蛋白(Wilms tumor 1 associated protein,WTAP)間接定位在核斑點上,S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)作為甲基供體,在METTL3和METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將甲基轉(zhuǎn)移到腺苷(A)堿基第6位的氮上，形成N6-甲基腺苷(m6A)。另外，METTL16、KIA也是甲基轉(zhuǎn)移酶的組分之一,協(xié)同作用于甲基化過程[10-11]。m6A結(jié)合蛋白可以識別甲基化修飾，影響mRNA的命運。m6A結(jié)合蛋白主要包括YTH結(jié)構域蛋白家族YTHDF1-3、YTHDC1-2等，還有部分hnRNA蛋白家族，比如hnRNA2B1等[12]。與甲基化酶具有逆向作用的去甲基化酶，肥胖相關蛋白(fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO)和ALKBH同源蛋白5(Alk B homologue 5，ALKBH5)，能對已發(fā)生m6A修飾的堿基進行去甲基化修飾[13]。甲基化和去甲基化是由各自酶作用的可逆化學過程，用于動態(tài)平衡m6A的活性。

METTL14是m6A 的核心酶之一，與METTL3形成異質(zhì)二聚體[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，METTL14可能在多種細胞分化發(fā)育過程中起到?jīng)Q定細胞命運的作用。沉默處理METTL3和 METTL14可抑制小鼠胚胎干細胞的自我更新[15]。在晚期精原細胞分裂過程中，METTL3和METTL14 2個基因聯(lián)合缺失會破壞精子發(fā)生[16]。然而，點突變METTL14 和METTL3活性中心的關鍵氨基酸，發(fā)現(xiàn)METTL3突變后會導致異質(zhì)二聚體的活性降低，而METTL14活性并沒有明顯的改變，說明METTL14是異質(zhì)二聚體的非催化亞基，其在甲基化過程中具有特異性功能。在小鼠睪丸間質(zhì)細胞分化過程中，METTL14表達量逐漸降低，表明m6A修飾與睪丸激素合成過程中睪丸間質(zhì)細胞的自噬之間存在負相關，在睪丸間質(zhì)細胞啟始階段METTL14表達量最高[17]。缺少METTL14的小鼠Treg細胞(功能調(diào)節(jié)性T細胞)的轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達降低，表明METTL14缺乏會導致Treg細胞的誘導分化受損[18]。敲除小鼠胚胎大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細胞中的METTL14，皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生會遲緩到出生后階段，膠質(zhì)細胞的細胞周期也會延長[19]。m6A修飾在哺乳動物前體脂肪細胞分化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，WTAP/METTL3/METTL14復合物通過促進細胞有絲分裂周期轉(zhuǎn)變積極調(diào)控脂肪發(fā)生，敲除這3個基因會使細胞周期蛋白A2上調(diào)，導致細胞周期停止，影響脂肪細胞分化[20]。對豬脂肪細胞早期增殖分化與脂質(zhì)代謝能力的研究發(fā)現(xiàn)，過量的支鏈氨基酸(branched-chain amino acids，BCAA)能使豬前體脂肪細胞中METTL14下調(diào)，從而通過m6A RNA甲基化修飾的方式抑制脂質(zhì)代謝的過程[21]。熱應激時脂肪細胞大量從血液中攝取甘油三酯并沉積在脂肪組織中，此時m6A甲基化水平提高，甲基化的作用大于去甲基化的作用，METTL14在脂肪組織中的表達量顯著提高[22-23]。所有這些結(jié)果均表明，METTL14在細胞分化、脂肪沉積等過程中有著重要作用。目前，m6A修飾在脂肪沉積中的相關研究主要集中在去甲基化酶FTO的研究上[24]，而METTL14與反芻動物脂肪沉積之間的研究尚不清楚。本試驗通過對大通牦牛METTL14進行克隆及序列分析，依據(jù)分子生物信息學技術，在分子和細胞2個層面，分析牦牛脂肪組織中METTL14的生物信息學特性及表達規(guī)律，以期為闡釋METTL14調(diào)控高原家畜脂肪沉積的特異性分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 組織樣品選取體質(zhì)量相近的18月齡和30月齡的大通牦牛各3頭，屠宰后采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌、皮下脂肪組織，用PBS洗滌，液氮過夜，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞體外培養(yǎng)牦牛前體脂肪細胞由實驗室前期培養(yǎng)并提供[25]，細胞貼壁生長至培養(yǎng)孔底面積的70%左右時，用胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和地塞米松處理脂肪細胞2 d，誘導其分化，此后，每隔1 d用含10%胎牛血清和10 mg/L胰島素的培養(yǎng)液替換正常培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)12 d[26]。

1.3 主要試劑PrimeSTAR HS DNA Polymerase、PrimeScriptTMRT reagent Kit、pMD19-T Vector Cloning Kit、TRIzol、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit購自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、E.ColiDH5α感受態(tài)細胞、TIANgel Midi Purification Kit購自北京全式金生物技術公司；氨芐西林、三氯甲烷購自Sigma公司。

1.4 主要儀器低溫離心機購自蘇州培英實驗設備有限公司；梯度PCR儀購自美國伯樂公司；壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠；Bio-Rad CFX 96 qRT-PCR購自時代聯(lián)想生物科技有限公司；生物安全柜購自上海力申科學儀器有限公司。

1.5 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄取-80℃保存的組織，為提高提取的RNA質(zhì)量，脂肪組織提取前去除油脂[27]，加入液氮研磨后用TRIzol試劑、三氯甲烷提取RNA；牦牛前體脂肪細胞用六孔板培養(yǎng)至12 d，分別收集培養(yǎng)時間為0,4,8,12 d的細胞并用TRIzol試劑、三氯甲烷提取細胞總RNA。用紫外分光光度計測定RNA含量及純度(D260 nm/D280 nm>1.8)，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。用PrimeScrip RT reagent Kit將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成長片度cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 牦牛METTL14引物設計與合成根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的野牦牛METTL14(XM_005898072.2)序列,確定METTL14的CDS區(qū)，采用Primer-BLAST設計METTL14的PCR擴增引物、qRT-PCR引物以及qRT-PCR內(nèi)參基因β-actin引物，引物相關信息見表1。

表1 METTL14擴增及qRT-PCR所用引物信息

1.7 牦牛METTL14的克隆與測序根據(jù)TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit的說明書操作，將牦牛脂肪組織RNA反轉(zhuǎn)錄成長片段cDNA，以此為模板，用METTL14上游引物F、下游引物R擴增牦牛METTL14的CDS區(qū)全長序列。反應體系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，METTL14-F/R各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55.1℃退火30 s，72℃延伸2 min，37個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細胞中，涂布到含氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h后，進行菌液PCR鑒定，將陽性菌液送西安擎科生物技術有限公司進行測序。

1.8 牦牛METTL14的生物信息學分析將METTL14測序結(jié)果用SeqMan拼接后，用表2中生物學軟件進行基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構分析。

表2 核苷酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具

1.9 牦牛METTL14 qRT-PCR檢測選用β-actin(NM_001009784)作為內(nèi)參基因，Primer-BLAST設計qRT-PCR引物(表1)。使用Bio-Rad CFX 96 qRT-PCR儀檢測目的基因及內(nèi)參基因的表達量，每組設生物學重復和技術重復(3×3)。反應體系10 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ5 μL，METTL14-F/R(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，ddH2O 3.4 μL。反應條件：95℃預變性1 min；95℃變性30 s，61.4℃退火30 s，95℃延伸30 s，45個循環(huán)；55℃延伸2 s。觀察熒光信號的變化，信號強度隨著溫度的升高先上升后降低，且形成單一峰，說明產(chǎn)物特異性良好。

2.0 統(tǒng)計分析qRT-PCR結(jié)果采用2-△△Ct方法進行分析，數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤表示，用SPSS 23.0軟件進行比較平均值中的獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 牦牛METTL14編碼基因擴增及克隆根據(jù)野牦牛METTL14 mRNA設計特異性引物，以大通牦牛脂肪組織cDNA 為模版進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，通過紫外凝膠成像儀觀察到在1 666 bp 附近出現(xiàn)清晰條帶(圖1)，特異性良好，與預期結(jié)果相符。

M.DL2000 DNA Marker；1～4.METTL14擴增產(chǎn)物圖1 牦牛METTL14的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 牦牛METTL14 mRNA CDS區(qū)序列分析目的基因測序結(jié)果經(jīng)SeqMan軟件拼接，獲得METTL14 cDNA序列的長度為1 666 bp，與預期一致。使用NCBI的ORF Finder進行分析，獲得1個1 371 bp 的最長ORF，與GenBank中公布的野牦牛(XM_005898072.2)METTL14 mRNA CDS的同源性為99.81%，因此，確定大通牦牛METTL14 CDS區(qū)長度為1 371 bp，編碼456個氨基酸。

2.3 牦牛METTL14基因及其編碼蛋白同源性比對分析和系統(tǒng)進化樹構建

2.3.1METTL14基因及其編碼蛋白序列同源性比對 將牦牛METTL14的核苷酸序列與GenBank中與野牦牛(Bosmutus，XM_005898072.2)、黃牛(Bostaurus，NM_001083714.1)、綿羊(Ovisaries，XM_004009592.4)、豬(Susscrofa，XM_003129231.6)、雙峰駱駝(Camelusbactrianus，XM_010952608.1)、人(Homosapiens，NM_020961.4)、野馬(Equusprzewalskii，XM_008534527.1)、獼猴(Macacanemestrina，XM_011748914.2)、兔(Musmusculus，NM_201638.2)、小鼠(Musmusculus，NM_201638.2)、雞(Gallusgallus，NM_001031148.1)等11個物種該基因CDS區(qū)序列進行同源性比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大通牦牛METTL14核苷酸序列與野牦牛、黃牛、綿羊、豬、雙峰駱駝、人、野馬、獼猴、兔、小鼠和雞苷酸序列的同源性分別為99.8%，99.6%，99.0%，95.5%，95.1%，95.1%，94.8%，94.5%，92.0%，89.9%和81.5%(圖2)；大通牦牛METTL14氨基酸序列與GenBank中的野牦牛(Bosmutus,XP_005898134.1)、綿羊(Ovisaries，XP_004009641.1)、野馬(Equusprzewalskii，XP_008532749.1)、黃牛(Bostaurus，NP_001077183.1)、豬(Susscrofa，XP_003129279.3)、獼猴(Macacanemestrina，XP_011747216.1)、人(Homosapiens，NP_066012.1)、雙峰駱駝(Camelusbactrianu，XP_010950910.1)、兔(Oryctolaguscuniculus，P_002717295.2)、小鼠(Musmusculus，XP_004009641.1)、雞(Gallusgallus，NP_001026319.1)等11個物種的氨基酸序列同源性分別為99.6%，99.6%，99.6%，99.3%，99.1%，99.1%，99.1%，98.9%，98.9%，98.3%，93.5%(圖3)。

圖2 大通牦牛與其他物種METTL14核苷酸序列同源性對比結(jié)果

圖3 大通牦牛與其他物種 METTL14蛋白氨基酸序列同源性比對結(jié)果

2.3.2METTL14核苷酸序列系統(tǒng)進化樹分析 通過MEGA 7.0軟件構建核苷酸同源性系統(tǒng)進化樹，分析了包括大通牦牛METTL14 CDS區(qū)在內(nèi)的11個物種該基因的CDS區(qū)核苷酸序列。建樹結(jié)果(圖4)表明，在11個物種中，大通牦牛METTL14和野牦牛的親緣關系最近，與雞和小鼠的親緣關系最遠。

圖4 牦牛METTL14系統(tǒng)進化樹

2.4 牦牛METTL14蛋白質(zhì)分析

2.4.1蛋白及核酸理化性質(zhì)分析 經(jīng)BioEdit軟件分析發(fā)現(xiàn)，METTL14堿基分布情況為：A、G、C和T平均含量分別為32.60%，18.31%，24.95%和24.14%，其中G+C的平均含量(43.25%)低于A+T平均含量(56.75%)，表明該基因堿基使用存在偏向性，偏好使用AT堿基。經(jīng)ProtParam軟件分析發(fā)現(xiàn)，大通牦牛METTL14分子式為C2277H3575N669O709S16，其相對分子質(zhì)量為52 193.33 kDa，等電點為5.89，氨基酸組分中谷氨酸含量(10.50%)最高，色氨酸含量(1.30%)和蛋氨酸含量(1.30%)最少(表3)。METTL14分子中正電荷氨基酸殘基 (Arg+Lys) 70個，負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu) 77個。METTL14的脂肪系數(shù)(AI)為66.14，不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為52.76，總平均親水指數(shù)(GRAVY)為-0.878。

表3 牦牛METTL14蛋白的氨基酸組分

2.4.2METTL14親水性/疏水性預測 經(jīng)ExPASyProtScale軟件預測發(fā)現(xiàn)，METTL14親水性氨基酸的總分值高于疏水性氨基酸(圖5)，牦牛METTL14總體表現(xiàn)出強的親水性，與GRAVY值預測相符。多肽鏈第429位精氨酸(R)親水性最強(-3.300)；第234位色氨酸(W)疏水性最強(1.544)。

圖5 牦牛METTL14蛋白的親疏水性分析

2.4.3METTL14結(jié)構域預測 通過CDD軟件對METTL14的保守結(jié)構域預測顯示，在METTL14氨基酸序列的186～363位有1個MT-A70結(jié)構域(圖6)，E-value=8.22e-80。MT-A70是mRNA上SAM的結(jié)合亞基，可特異地甲基化前體pre-mRNA中的腺嘌呤。

圖6 牦牛METTL14蛋白保守結(jié)構域

2.4.4METTL14信號肽和跨膜結(jié)構域預測運用 SignalP 4.1分析METTL14氨基酸序列，預測有信號肽的概率是0.092%，C值為0.111，Y值為0.119，S值為0.161，S-mean及D-mean值分別為0.127、0.132，均小于閾值0.450，說明METTL14 無信號肽(圖7)。通過TMHMM METTL14跨膜結(jié)構域進行預測(圖8)，顯示METTL14均處于膜內(nèi)，即METTL14無跨膜結(jié)構域，不是膜蛋白。

圖7 牦牛METTL14蛋白信號肽預測

圖8 牦牛METTL14蛋白跨膜結(jié)構域預測

2.4.5METTL14亞細胞定位與核定位預測 用PSORT預測METTL14亞細胞定位，k-NN預測結(jié)果(表4)顯示METTL14定位在細胞核上(69.60%)。用cNLS-mapper對METTL14進行分析，發(fā)現(xiàn)其存在一段核定位序列，序列為PNAKRKYQDE (score=8)，位置在59～70位之間。

表4 牦牛METTL14亞細胞定位預測

2.4.6METTL14潛在磷酸化位點預測 使用NetPhos 3.1 Server分析METTL14的氨基酸序列潛在磷酸化位點，結(jié)果顯示，該序列具有40個潛在的磷酸化位點，絲氨酸(serine)、蘇氨酸(threonine)及酪氨酸(tyrosine)占比分別為35%,42.5%和22.5%(圖9)。

圖9 牦牛METTL14基因氨基酸序列潛在磷酸化位點分析

2.4.7METTL14二級結(jié)構預測 利用Sopma軟件預測牦牛METTL14二級結(jié)構(圖10)，發(fā)現(xiàn)牦牛METTL14中的無規(guī)則卷曲占51.10%、α-螺旋占33.11%，氨基酸殘基連接成的延伸鏈占11.84%，β-轉(zhuǎn)角占3.95%。其中，柔性無規(guī)則卷曲占比較高。

A.蛋白質(zhì)二級結(jié)構位點圖(h.α-螺旋；c.無規(guī)則卷曲；t.β-轉(zhuǎn)角；e.延伸)；B.蛋白質(zhì)二級結(jié)構峰圖；C.蛋白質(zhì)二級結(jié)構豎條紋圖。紫色.示無規(guī)則卷曲；藍色.示α-螺旋；紅色.示延伸鏈；綠色.示β-轉(zhuǎn)角圖10 牦牛METTL14蛋白二級結(jié)構預測

2.4.8METTL14三級結(jié)構預測 使用SWISS-MODEL軟件對牦牛METTL14氨基酸序列進行同源建模(圖11)，全局模型質(zhì)量估計(global model quality estimation，GMQE)值為0.68，發(fā)現(xiàn)牦牛METTL14三級結(jié)構主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈構成。

圖11 牦牛METTL14蛋白三級結(jié)構預測

2.4.8METTL14蛋白互作網(wǎng)絡預測 通過STRING軟件構建了METTL14互作蛋白網(wǎng)絡，結(jié)果如圖12所示，牦牛METTL14相互作用的蛋白有10個，包括作用于DNA(或RNA)甲基化過程的METTL3、METTL4等MT-A70家族蛋白，參與修復被甲基化損傷的DNA(或RNA)的ALKBH1、ALKBH5等AlkB家族蛋白，以及WTAP、ENSBTAG00000002641、KIAA1429、YTHDF1、CBLL1等其他參與m6A甲基化修飾的相關蛋白。METTL14在這個互作網(wǎng)絡中有RNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性、RNA結(jié)合和催化等分子功能，與各互作蛋白共同參與RNA的甲基化修飾、轉(zhuǎn)運加工、剪接等生物過程。

圖12 牦牛METTL14蛋白互作網(wǎng)絡預測

2.5 METTL14表達譜分析qRT-PCR結(jié)果顯示，METTL14 mRNA在牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌和皮下脂肪組織中都有所表達，但存在一定的差異，METTL14在肝臟高表達，在脾臟則低表達；與脂肪組織中的表達量相比，METTL14在脾臟的表達量最低，差異極顯著(P<0.001)；在心臟、背最長肌的表達量極顯著高于脂肪組織(P<0.01) (圖13A)。牦牛生長發(fā)育不同階段METTL14的表達量也有差異，30月齡牦牛脂肪組織中METTL14表達量顯著高于18月齡的(P<0.05) (圖13B)，表明牦牛METTL14隨著個體生長發(fā)育的進行，表達也表現(xiàn)出差異。為了進一步探究METTL14在牦牛前體脂肪細胞分化過程中的動態(tài)變化規(guī)律，誘導牦牛前體脂肪細胞分化并培養(yǎng)12 d，發(fā)現(xiàn)隨著前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化，METTL14在0，4，8，12 d的表達量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，4，8 d的表達量顯著高于0 d (P<0.05)，并且12 d的表達量極顯著高于0 d (P<0.01) (圖13C)，表明在脂肪細胞分化后期METTL14發(fā)揮著重要的作用。

A.牦牛METTL14基因在不同組織中的表達；B.牦牛METTL14基因在2個不同時期的表達；C.牦牛METTL14基因在脂肪細胞分化過程中的表達(0，4，8，12 d)。*.示P<0.05;**.示0.05

3 討論

本試驗經(jīng)克隆獲得牦牛脂肪組織METTL14基因的完整CDS區(qū)，由起始密碼子ATG開始到終止密碼子TAG結(jié)束共1 371 bp。大通牦牛METTL14核苷酸與氨基酸序列與其他物種同源性比較結(jié)果顯示，11個物種之間都有差異但相似性很高，說明METTL14基因結(jié)構和功能存在物種及品種特異性，但也保持了酶自身在不同物種中的一致性，進一步說明依賴METTL14功能的m6A在真核生物中廣泛存在。大通牦牛METTL14基因和野牦牛親源關系最近，與雞和小鼠的親緣關系最遠。這3組進化關系數(shù)據(jù)說明METTL14具有高度保守性，但存在一定的種屬特異性，不同物種間保守性不高。

大通牦牛METTL14基因CDS區(qū)共編碼456個氨基酸，相對分子質(zhì)量為52 193.33 kDa，負電荷氨基酸殘基總數(shù)比正電荷氨基酸殘基總數(shù)多20個，其-COOH解離程度大于-NH3解離程度，等電點為5.89，表明METTL14為酸性氨基酸；親疏水性預測結(jié)合GRAVY值，可以判斷METTL14具有較強的親水性，有利于其在細胞內(nèi)發(fā)揮活性； METTL14在氨基酸序列186～363位預測到1個MT-A70的保守結(jié)構域，此結(jié)構域比較接近DNA6mA的甲基轉(zhuǎn)移酶。有研究表明，METTL14是DNA6mA同源物的一個獨立亞分支，MT-A70酶結(jié)構域和具有替代機制偏好的結(jié)構域相連，催化DNA6mA的形成[28]。由此推斷，牦牛METTL14中MT-A70的保守結(jié)構域維持了甲基轉(zhuǎn)移酶的保守機制；有試驗用免疫共沉淀法定位WTAPMETTL3METTL14酶復合物，發(fā)現(xiàn)其定位在細胞核上且富集在核斑點上，并一一對復合物的單個蛋白進行核定位信號(nuclear localization signals，NLS)預測，發(fā)現(xiàn)METTL14不包含功能性NLS，而METTL3和METTL14構成的異質(zhì)二聚體在細胞質(zhì)中形成，細胞質(zhì)中METTL3的功能性NLS攜帶METTL14一起轉(zhuǎn)運到核中[29]，這與預測的METTL14的信號肽概率為0.092%，幾乎不存在引導蛋白質(zhì)定位到亞細胞內(nèi)的短肽序列的結(jié)果一致，而且METTL14不屬于分泌蛋白沒有跨膜結(jié)構域，所以新合成的METTL14沒有分泌通路，無法分泌到細胞外而存在于細胞質(zhì)中，但本試驗METTL14亞細胞定位主要定位在細胞核上，細胞質(zhì)中有4.3%，核定位預測結(jié)果同樣有69.60%的該蛋白定位在細胞核上，其可能原因與它的功能相關，METTL14雖然不具有單獨的m6A催化活性，但METTL14在細胞核中決定RNA上靶基因的結(jié)合，促進METTL3的催化，參與了RNA甲基化修飾。牦牛METTL14潛在磷酸化位點總共有40個，其中蘇氨酸上潛在的磷酸化位點數(shù)占42.5%，高于絲氨酸(35%)及酪氨酸(22.5%)上的潛在磷酸化位點，磷酸化作用與甲基化作用一樣是蛋白質(zhì)性質(zhì)改變的方法之一，同樣需要通過激活來影響蛋白理化性質(zhì)；METTL14和METTL3的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構域緊密結(jié)合在一起，形成異質(zhì)二聚體，METTL3和 METTL14中各有56個和67個氨基酸參與了相互作用，互作界面的氨基酸非常保守，研究中作者根據(jù)結(jié)構設計了一系列的點突變，但還是很難破壞其穩(wěn)定結(jié)構[30]。但METTL14的不穩(wěn)定系數(shù)為52.02，是不穩(wěn)定水溶性酸性蛋白，其高級結(jié)構以無規(guī)則卷曲為主，卷曲的柔性構象會使肽鏈改變走向，METTL14自身不具備穩(wěn)定的結(jié)構基礎，由此推測METTL14單獨表達時，疏水互作界面暴露出來，導致蛋白不穩(wěn)定而與METTL3互作共表達時2個蛋白相互起到穩(wěn)定異質(zhì)二聚體構象的作用。在METTL3和METTL14之間有1條富含正電荷的溝槽對RNA 的結(jié)合有著重要的功能[30]，參與RNA甲基化修飾、RNA轉(zhuǎn)運加工、剪接等生物過程。

METTL14在18齡大通牦牛各組織中均有表達，心臟、背最長肌中的表達高于脂肪組織中的表達，在脾臟表達量最低，表明牦牛METTL14的表達具有組織特異性，與動物代謝活動具有一定的相關性；隨著牦牛生長發(fā)育，30月齡的牦牛脂肪組織中METTL14表達量高于18月齡的，說明該基因的表達量受時空的影響；METTL14在牦牛前體脂肪細胞中的表達隨著前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞的發(fā)育呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，表明在脂肪細胞分化后期METTL14發(fā)揮著重要的作用。本研究從分子水平和細胞水平都表明METTL14基因的表達與脂肪沉積之間存在一定的相關性。

脂肪組織的發(fā)育是由一個復雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡調(diào)控的過程，除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，在以往的研究中發(fā)現(xiàn)可通過表觀遺傳分子機制調(diào)控脂肪的發(fā)育和脂質(zhì)的沉積，近年來除了DNA甲基化修飾、組蛋白修飾和染色質(zhì)空間重塑等DNA和蛋白質(zhì)上的化學修飾外，RNA修飾日趨成為表觀遺傳學領域的研究熱點[31-32]。新的證據(jù)表明，m6A修飾在動物生長發(fā)育過程中,對脂肪發(fā)育和脂質(zhì)沉積起著至關重要的作用[33-35]。 m6A修飾位點具有典型的一致序列DRACH(D=G，A或U；R=G或A；H=A、C或U)，前體mRNAs(pre-mRNAs)上的m6A可以招募剪接因子兩種核糖核蛋白A2和B1(HnRNPA2B1)或加強側(cè)翼RNA序列對剪接因子A2和B1的可變性[36]。據(jù)報道，METTL14可以對組蛋白H3賴氨酸36三甲基化(H3K36me3)修飾進行識別，并選擇性介導m6A富集在mRNA上[37]。構建Cre/loxP基因敲除小鼠，敲除METTL14會使小鼠胰島素β細胞中胰島素分泌量減少，促進肝臟脂肪分解，使脂肪細胞中的脂質(zhì)沉積減少[38]。m6A依賴METTL14修飾非編碼RNA，影響微小RNA microRNAs(miRNAs)的表達和環(huán)狀RNA(circRNA)的生物合成[39-40]，由此可見，理論上機體內(nèi)脂肪沉積的含量、脂質(zhì)代謝的過程可以通過METTL14基因進行微調(diào)。本試驗結(jié)果表明，METTL14在大通牦牛脂肪沉積過程中發(fā)揮了一定作用，但其作用于脂肪沉積的機制尚未明確。對此，后期可將METTL14作為調(diào)控牦牛m6A脂肪沉積的候選基因進一步研究。本試驗進一步為METTL14基因在牦牛脂肪沉積調(diào)控機制的研究奠定了理論基礎。