王首寒，武 艷，孫小單

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科，吉林 長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤醫(yī)院病理科，吉林 長(zhǎng)春 130012；3.吉林省腫瘤醫(yī)院博士后工作站，吉林 長(zhǎng)春 130012)

沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白7(silent information regulator 2 homolog protein 7，SIRT7)是哺乳動(dòng)物Sirtuins家族成員之一，為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的第三類組蛋白去乙?；?，參與細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)及核糖體RNA轉(zhuǎn)錄與修飾等重要生理過(guò)程[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT7在多種人類惡性腫瘤中異常高表達(dá)[2-14]，提示其可能作為促癌基因發(fā)揮作用。相反地，在頭頸部鱗癌組織中檢測(cè)到SIRT7表達(dá)下調(diào)。此外，SIRT7還參與多種腫瘤的放化療抵抗等[3,15]。目前有關(guān)SIRT7在胰腺癌中的表達(dá)及其與免疫浸潤(rùn)水平關(guān)系的研究較少。本研究基于生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床組織驗(yàn)證等方法，分析SIRT7在胰腺癌中的表達(dá)及其與免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(www.oncomine.org)為在線腫瘤芯片數(shù)據(jù)庫(kù)[16]，用于研究分析SIRT7mRNA在胰腺癌與正常胰腺組織中的表達(dá)情況。搜索內(nèi)容和閾值設(shè)置如下:①基因，SIRT7；②分析類型，Cancer vs. Normal；③數(shù)據(jù)類型，DNA and mRNA；④樣品類型，Clinical Specimen；⑤數(shù)據(jù)集篩選標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05，fold change=2，gene rank=Top 10%。將所得結(jié)果匯總后，進(jìn)一步篩選“癌癥類型：Pancreatic Cancer”。篩選結(jié)果以箱式圖呈現(xiàn)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)是用來(lái)查詢腫瘤組織與正常組織之間差異表達(dá)基因等多種信息的工具[17]。通過(guò)“Boxplot”模塊分析SIRT7 mRNA在正常胰腺及胰腺癌組織中的表達(dá)。

1.2免疫組織化學(xué)染色 收集2019年1月—2020年12月吉林省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科手術(shù)切除的胰腺癌組織標(biāo)本27例，并收集對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)作為對(duì)照。所有患者均為初治患者，術(shù)前未行其他治療。所有標(biāo)本均經(jīng)由本院病理科證實(shí)。將標(biāo)本固定在10%多聚甲醛中，石蠟包埋，切成4 mm切片。經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟和濃度梯度酒精脫水，檸檬酸pH 6.0高溫高壓抗原修復(fù)3 min，普通羊血清封閉，將切片與SIRT7兔多克隆抗體(Proteintech,武漢，稀釋比例1∶100)共同孵育4 ℃過(guò)夜。次日復(fù)溫30 min，DAB法(北京中杉金橋有限公司)顯色1 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，自來(lái)水流水反藍(lán)，最后進(jìn)行梯度酒精、無(wú)水乙醇、二甲苯脫水透化后封片。正置顯微鏡拍照。

1.3TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析 TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB/)是腫瘤與免疫系統(tǒng)交互的數(shù)據(jù)庫(kù)，用于基因表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞豐度相關(guān)性分析[18]。檢索SIRT7基因，選擇“Lymphocyte”，選擇“Pancreatic adenocarcinoma”，item分別選擇“效應(yīng)記憶T細(xì)胞(Effector memory CD8+T cell)”、“活化B細(xì)胞(activated B cell)”、“自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK cell)”、“自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell，NKT cell)”及“輔助T細(xì)胞17(type 17 helper T cell，Th17 cell)”，探討SIRT7表達(dá)與胰腺癌免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。

1.4cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析 cBioPortal(http://cbioportal.org)是用于查詢、分析和可視化來(lái)自多種數(shù)據(jù)庫(kù)的多維癌癥基因組數(shù)據(jù)的開(kāi)放式網(wǎng)頁(yè)資源[19]。選擇胰腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)集，應(yīng)用Oncoprint模塊分析SIRT7基因變異情況。

1.5STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)是一個(gè)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間功能關(guān)聯(lián)的生物數(shù)據(jù)庫(kù)[20]。檢索SIRT7蛋白，物種選擇人類，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。下載生物學(xué)功能及京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析結(jié)果，利用Excel軟件進(jìn)行匯總，可視化與SIRT7相互作用蛋白的生物學(xué)功能及所參與的通路。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1SIRT7mRNA在胰腺癌中的表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中共有365項(xiàng)關(guān)于SIRT7基因的常見(jiàn)腫瘤類型的研究，符合篩選條件的、SIRT7表達(dá)差異顯著的研究結(jié)果有32個(gè)(P<0.05)。其中有2個(gè)胰腺癌數(shù)據(jù)集提示SIRT7表達(dá)水平在癌組織中高于正常組織(圖1A)。在Pei Pancreas數(shù)據(jù)集中，SIRT7 mRNA在36例胰腺癌組織中的表達(dá)水平是16例正常胰腺組織中的1.678倍(P=3.58×10-8，圖1B)。在Grutzmann Pancreas數(shù)據(jù)集中，SIRT7 mRNA在11例胰腺癌組織中的表達(dá)水平是11例正常胰腺導(dǎo)管組織的2.004倍(P=0.033，圖1B)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，179例胰腺癌組織中SIRT7 mRNA表達(dá)水平明顯高于171例正常胰腺組織(P<0.05，圖2)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中SIRT7mRNA的表達(dá)情況A.SIRT7mRNA在常見(jiàn)腫瘤類型中的表達(dá)(紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào))；B.SIRT7mRNA在不同數(shù)據(jù)集中的胰腺癌與正常胰腺組織的差異表達(dá)Figure 1 The expression of SIRT7 mRNA based on Oncomine database

圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中SIRT7mRNA在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達(dá)Figure 2 The expression of SIRT7 mRNA in pancreatic cancer and normal tissues based on GEPIA database

2.2SIRT7蛋白在臨床樣本中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，SIRT7蛋白在癌旁組織中弱表達(dá)，而在胰腺癌組織中的表達(dá)增強(qiáng)，呈棕黃色顆粒樣，主要位于細(xì)胞漿及部分胞核(圖3)。胰腺癌組織中SIRT7蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 SIRT7在胰腺癌及癌旁組織的表達(dá)情況Table 1 The expression of SIRT7 in pancreatic cancer and adjacent tissues (n=27,例數(shù)，%)

圖3 SIRT7蛋白在胰腺癌及癌旁組織的表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×100)A.癌旁組織；B.胰腺癌組織Figure 3 The expression of SIRT7 protein in pancreatic cancer and adjacent normal tissues(immunohistochemistry ×100)

2.3SIRT7基因表達(dá)水平與胰腺癌免疫浸潤(rùn)豐度相關(guān)性 TISIDB 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示：SIRT7基因表達(dá)水平與胰腺癌浸潤(rùn)效應(yīng)記憶T細(xì)胞、活化B細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞的表達(dá)豐度呈負(fù)相關(guān)，而與Th17細(xì)胞的表達(dá)豐度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖4。

圖4 SIRT7與胰腺癌腫瘤免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性A.SIRT7與效應(yīng)記憶T細(xì)胞豐度相關(guān)性；B. SIRT7與活化B細(xì)胞豐度相關(guān)性；C. SIRT7與NK細(xì)胞豐度相關(guān)性；D. SIRT7與NKT細(xì)胞豐度相關(guān)性；E. SIRT7與輔助性T細(xì)胞17豐度相關(guān)性；Figure 4 Correlation of SIRT7 expression with immune infiltration level in pancreatic cancer圖5 cBioPortal平臺(tái)中SIRT7基因在胰腺癌中的變異情況Figure 5 The mutation landscape of SIRT7 in pancreatic cancer based on cBioportal

2.4SIRT7基因在胰腺癌中的變異情況 cBioPortal平臺(tái)共收集了749例胰腺癌樣本RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。其中，發(fā)生SIRT7基因變異13例，總變異率為1.73%。其中擴(kuò)增11例，缺失2例(圖5)。結(jié)果說(shuō)明，SIRT7基因在胰腺癌中的變異類型以擴(kuò)增為主，但其變異率并不高。

2.5與SIRT7相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)及基因富集分析 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建SIRT7蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中有10種蛋白與SIRT7蛋白相互作用明顯(P=3.74×10-8)，分別為組蛋白去乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)1/2/4/6/8/11、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O3(forkhead box O3，F(xiàn)OXO3)、錨蛋白重復(fù)域52(ankyrin repeat domain 52，ANKRD52)和WD和四三肽重復(fù)序列1(WD and tetratricopeptide repeats 1，WDTC1)(圖6)?；蚋患治鼋Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述蛋白主要參與的生物學(xué)過(guò)程及通路包括細(xì)胞周期、Notch、磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase-serine/threonine protein kinase,PI3K-AKT)等與胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子通路(圖7)。

圖6 與SIRT7蛋白相關(guān)的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 Network map of interaction proteins with SIRT7

圖7 與SIRT7相關(guān)基因的富集分析A.生物學(xué)功能富集分析；B.KEGG通路富集分析Figure 7 Enrichment analysis of SIRT7-intreacting genes

3 討 論

SIRT7是哺乳動(dòng)物Sirtuins家族七個(gè)成員之一，為第三類組蛋白去乙酰化酶[21]，具有多種催化活性，如對(duì)組蛋白H3K18發(fā)揮去乙?；痆22-23]、對(duì)組蛋白H3K122發(fā)揮去琥珀酰化[24]等作用，在RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄、核糖體合成、細(xì)胞應(yīng)激與代謝、維持基因組穩(wěn)定性等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。上述生理過(guò)程一旦發(fā)生異常，就會(huì)造成疾病甚至腫瘤的發(fā)生。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，SIRT7在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥過(guò)程中扮演重要角色。在肝癌中，SIRT7表達(dá)升高，且與不良預(yù)后有關(guān)，抑制SITR7表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞周期蛋白表達(dá)下降[3]；在非小細(xì)胞肺癌、胃癌、膀胱癌及卵巢癌細(xì)胞系中，SIRT7通過(guò)抗凋亡、激活凋亡相關(guān)通路等機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[2,5,9,13,25]，說(shuō)明SIRT7可能作為促癌基因發(fā)揮作用。此外，在前列腺癌、骨肉瘤及結(jié)直腸癌中，SIRT7不僅能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，還是放化療抵抗發(fā)生的關(guān)鍵因子[10,14-15]。相反地，在乳腺癌肺部轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)SIRT7的低表達(dá)，且SIRT7缺失激活了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路，增強(qiáng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，說(shuō)明SIRT7能夠起到抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用[26]。綜上所述，SIRT7能夠通過(guò)多種機(jī)制在惡性腫瘤中扮演著不同的角色，但由于腫瘤的異質(zhì)性、個(gè)體研究樣本量不足、研究方法單一等因素，所得結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，在365項(xiàng)SIRT7mRNA在常見(jiàn)惡性腫瘤表達(dá)情況的研究中，共有32個(gè)數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)其表達(dá)異常。在2個(gè)胰腺癌數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)SIRT7的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組。進(jìn)一步利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床組織標(biāo)本，分別在mRNA及蛋白水平上驗(yàn)證了SIRT7在胰腺癌組織中高表達(dá)，提示SIRT7可能是胰腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。除了靶向治療，免疫療法開(kāi)啟了腫瘤治療領(lǐng)域的新紀(jì)元，將靶向與免疫療法有機(jī)聯(lián)合有望成為胰腺癌治療的新策略[27]。腫瘤組織免疫浸潤(rùn)水平在一定程度上決定了免疫治療的有效性，而腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是存在于腫瘤間質(zhì)中的一類異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群，以T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞為代表，能夠反映腫瘤免疫浸潤(rùn)水平。本研究利用TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，SIRT7與胰腺癌浸潤(rùn)效應(yīng)記憶T細(xì)胞、活化B細(xì)胞、NK及NKT細(xì)胞的表達(dá)豐度呈負(fù)相關(guān)，提示SIRT7的表達(dá)抑制上述免疫細(xì)胞向胰腺癌組織中浸潤(rùn)。此外，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及免疫逃逸等密切相關(guān)的Th17細(xì)胞[28]的浸潤(rùn)豐度卻與SIRT7的表達(dá)明顯呈正相關(guān)。綜上所述，提示SIRT7的異常表達(dá)與胰腺癌免疫浸潤(rùn)水平密切相關(guān)，可能是免疫療效評(píng)估的潛在標(biāo)志物。若以SIRT7為治療靶點(diǎn)，理論上不僅可以抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，更有利于提高免疫治療療效。此外，739例胰腺癌樣本的RNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有13例發(fā)生了SIRT7基因變異，變異率較低，變異類型以擴(kuò)增為主。最后，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了SIRT7蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，主要有HDAC1/2/4/6/8/11、TP53、FOXO3等主要參與細(xì)胞周期、Notch、PI3K-AKT等腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)通路的蛋白與SIRT7蛋白具有明顯相互作用，提示SIRT7可能與上述互作蛋白協(xié)同在胰腺癌中發(fā)揮其生物學(xué)作用。本研究充分運(yùn)用多種綜合腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床組織樣本，初步證明了SIRT7在胰腺癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤免疫浸潤(rùn)水平密切相關(guān)，與其相互作用的蛋白參與胰腺癌相關(guān)分子通路。SIRT7可作為胰腺癌診斷、治療及免疫療效評(píng)估的良好生物學(xué)標(biāo)志物，具備一定應(yīng)用前景。

然而，本研究仍存在一些不足。首先，本研究臨床組織樣本有限，僅通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行驗(yàn)證，未來(lái)仍需增加樣本量，并結(jié)合多種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步明確SIRT7的表達(dá)情況。其次，該蛋白在胰腺癌中突變率較低，且作用機(jī)制復(fù)雜，后續(xù)亦應(yīng)結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索SIRT7對(duì)胰腺癌生物學(xué)行為的影響。此外，腫瘤是一個(gè)復(fù)雜的整體，異質(zhì)性較強(qiáng)，其發(fā)生發(fā)展不是某個(gè)獨(dú)立因子可以決定的，因此，尋找胰腺癌中能與SIRT7發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用的分子仍是未來(lái)研究重點(diǎn)。此外，值得注意的是，本研究利用了多種數(shù)據(jù)庫(kù)，各數(shù)據(jù)庫(kù)之間樣本的聯(lián)系整合及連續(xù)性仍有待提高。