賈曉青，孫曉寅，蔣蓓琦，梅章懿，傅 韻，莊志剛

同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院乳腺科，上海 201204

Neddylation修飾是新近發(fā)現(xiàn)的一種類泛素化蛋白翻譯后修飾方式，類泛素分子神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白8（neural precursor cell expressed,developmentally downregulated 8，NEDD8）在NEDD8活化酶1（NEDD8-activating enzyme 1，NAE1）、NEDD8結(jié)合酶UBC12和底物特異性NEDD8-E3連接酶的催化下，經(jīng)過三步級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)被活化，活化的NEDD8結(jié)合到其底物蛋白上并使之通過蛋白酶體降解［1］。Cullin家族作為多亞基Cullin-RING E3連接酶（Cullin-RING ligases，CRL）的必要組成部分，是neddylation最常見的底物［2］。CRL通過靶向數(shù)以百計(jì)的蛋白，主要是抑癌蛋白并使之通過蛋白酶體降解，從而調(diào)控多種生物學(xué)過程［3］。CRL的功能異常將會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［4］。研究發(fā)現(xiàn)neddylation修飾在多種腫瘤中高度活化，包括肺癌［5］、肝癌［6］、腦膠質(zhì)瘤［7］和淋巴瘤［8］等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)靶向neddylation修飾可顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究［9］發(fā)現(xiàn)，neddylation修飾在乳腺癌中過度活化，靶向neddylation修飾可增加雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌對(duì)氟維司群的敏感性。在研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)靶向neddylation修飾可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老，其具體機(jī)制仍不清楚。

核纖層位于核外緣，緊靠核膜，維持細(xì)胞核的大小、形狀和穩(wěn)定性［10］。核纖層主要成分是核纖層蛋白，包括A型核纖層蛋白（lamin A）和B型核纖層蛋白（lamin B）［11］。哺乳動(dòng)物中，lamin A包括lamin A和lamin C，兩者是同一基因的兩種不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有相同的氨基酸序列。Lamin B包括lamin B1和lamin B2［11］。核纖層參與多種細(xì)胞核活動(dòng)，包括DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和重塑、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞發(fā)育和分化、細(xì)胞核遷移及細(xì)胞凋亡［11-14］。此外，核纖層還維持細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)，調(diào)控核孔復(fù)合體（nuclear pore complex，NPC）及啟動(dòng)細(xì)胞有絲分裂［15］。研究［16］報(bào)道，lamin B1缺失誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，其在細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。我們推測靶向neddylation修飾誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老與lamin B1有關(guān)，Neddylation修飾與lamin B1可能存在相關(guān)性，本研究旨在探索neddylation修飾與lamin B1之間是否存在調(diào)控關(guān)系及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

MCF-7細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）均購自美國Gibco公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，抗NEDD8抗體購自美國Cell signaling Technology公司，抗NAE1抗體購自德國默克公司，抗lamin B1抗體購自上海泊灣生物科技有限公司，抗P53抗體購自美國Santa Cruz公司，GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG（H+L）二抗購自美國Proteintech公司，免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自丹麥DAKO公司。

1.2 CRISPR/Cas9技術(shù)敲低NEDD8

首先構(gòu)建NEDD8gRNA 質(zhì)粒。在網(wǎng)站（http://www.genome-engineering.org/crispr/）上進(jìn)行NEDD8 gRNA的設(shè)計(jì)。將針對(duì)NEDD8的gRNA序列分別克隆至lenti-guide-puro質(zhì)粒中。將包含NEDD8 gRNA的lenti-guide-puro質(zhì)粒（4 μg）與慢病毒包裝質(zhì)粒AGP091（3.0μg）和AGP090（1.2μg）共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。48 h后收集、過濾病毒上清液，并感染MCF-7/Cas9細(xì)胞，用嘌呤霉素（2 μg/mL）篩選1～2周，從而獲得NEDD8穩(wěn)定敲低細(xì)胞系。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長融合度達(dá)80%時(shí)，加入胰蛋白酶消化并傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右。將20 μL P53-RNAi片段及20 μL NC-RNAi片段分別與100 μL不含10%胎牛血清的空RPMI-1640培養(yǎng)基混勻，靜置5 min；同時(shí)將6 μL LipofectamineTM2000與不含10%胎牛血清的空RPMI-1640培養(yǎng)基混勻，靜止5 min；將以上兩種復(fù)合物混勻，靜置20 min，輕輕滴加至細(xì)胞中，充分混勻。6～8 h后更換含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

在6 cm培養(yǎng)皿中加入100 μL RIPA裂解液，置于冰上，用細(xì)胞刮迅速將細(xì)胞刮下，移至預(yù)冷的1.5 mL Eppendorf試管中，冰上裂解40 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的預(yù)冷1.5 mL Eppendorf試管中，利用蛋白定量試劑盒調(diào)整蛋白濃度一致。加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS）上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min。冷卻至室溫后進(jìn)行SDSPAGE電泳。60 V恒壓電泳2 h，220 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入一抗（NEDD8、NAE1、lamin B1、P53和GAPDH）4 ℃過夜，次日TBST洗滌10 min×3次后加二抗室溫溫育1 h，TBST洗滌10 min×3次后，加入ECL發(fā)光顯影。

1.5 臨床標(biāo)本收集

乳腺癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司。該組織芯片包含2000年1月—2003年12月接受手術(shù)的113例乳腺癌患者，有完整的臨床及病理學(xué)資料，包括年齡、腫瘤大小、腫瘤分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)、ER及孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）蛋白表達(dá)等。該項(xiàng)研究已經(jīng)相關(guān)倫理委員會(huì)通過。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測

石蠟包埋組織切片常規(guī)脫蠟，用含3%過氧化氫的甲醇溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶。對(duì)neddylation修飾過程中關(guān)鍵蛋白NEDD8和NAE1，采用0.01 mol/L檸檬酸溶液（pH=6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，煮沸20 min，取出后置于檸檬酸緩沖液中在室溫下自然冷卻。對(duì)于lamin B1，采用EDTA溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，煮沸10 min，取出后置于EDTA溶液中在室溫下自然冷卻。封閉20 min。依次加入鼠抗人NAE1（1∶100）單克隆抗體、兔抗人NEDD8（1∶80）多克隆抗體和兔抗人lamin B1多克隆抗體（1∶1 000），即用型辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫溫育1 h，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色細(xì)胞核，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封固。PBS代謝一抗作為陰性對(duì)照，其余步驟同上。用已知陽性切片作為各蛋白的陽性對(duì)照。

1.7 染色結(jié)果判讀

隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞和陽性細(xì)胞數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率。本課題前期研究［9］報(bào)道了NEDD8和NAE1的免疫染色結(jié)果。對(duì)于lamin B1染色結(jié)果的判斷，陽性細(xì)胞率0%～5%記為0分，6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。再按多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度予以計(jì)分，低表達(dá)為1分，中等表達(dá)為2分，強(qiáng)表達(dá)為3分。將上述2項(xiàng)得分相加，0～1分判為“-”，2～3分判為“+”，4分判為“++”，5～7分判為“+++”。由3位有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師閱片，采用雙盲評(píng)估的方法，根據(jù)其評(píng)分的平均值來確定判定結(jié)果。本研究進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，以“++”和“+++”定義該蛋白為高表達(dá)，“-”和“+”定義為低表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖表采用GraphPad Prism 8.0軟件繪制。相關(guān)性分析采用Spearman rank分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Neddylation修飾過程關(guān)鍵蛋白NEDD8和NAE1及l(fā)amin B1在乳腺癌中的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)方法分析了neddylation修飾過程關(guān)鍵蛋白NEDD8和NAE1及l(fā)amin B1在113例乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在NEDD8和NAE1高表達(dá)的組織中，lamin B1表達(dá)也升高；而在NEDD8和NAE1低表達(dá)的組織中，lamin B1表達(dá)也降低（圖1）。提示二者之間可能存在相關(guān)性。

圖1 免疫組織化學(xué)方法檢測NEDD8、NAE1及l(fā)amin B1在乳腺癌中的表達(dá)Fig.1 The expressions of NEDD8,NAE1 and lamin B1 in breast cancer were detected by immunohistochemistry

2.2 Neddyaltion修飾與lamin B1表達(dá)呈正相關(guān)

為了明確neddylation修飾與lamin B1表達(dá)之間是否存在相關(guān)性，我們進(jìn)一步進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，NEDD8（r=0.817，P＜0.000 1）和NAE1（r=0.406，P＜0.000 1）的表達(dá)與lamin B1表達(dá)呈顯著正相關(guān)（圖2）。

圖2 NEDD8和NAE1與lamin B1表達(dá)呈正相關(guān)Fig.2 The expressions of NEDD8 and NAE1 were positively correlated with lamin B1 expression

2.3 Neddylation修飾調(diào)控lamin B1表達(dá)

為了明確neddylation修飾是否調(diào)控lamin B1表達(dá)，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲低了乳腺癌MCF-7細(xì)胞中NEDD8表達(dá)（以下稱MCF-7/gNEDD8細(xì)胞）以阻斷neddylation修飾。通過Western blot方法檢測NEDD8敲低情況及其對(duì)lamin B1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，NEDD8成功被敲低（圖3A），敲低NEDD8顯著抑制了lamin B1的表達(dá)（圖3B）。

圖3 Neddylation修飾調(diào)控lamin B1的表達(dá)Fig.3 Neddylation modification regulates lamin B1 expression

2.4 Neddylation修飾通過P53依賴的方式調(diào)控lamin B1表達(dá)

我們進(jìn)一步研究了neddylation修飾如何調(diào)控lamin B1的表達(dá)。研究報(bào)道，細(xì)胞衰老標(biāo)志物P53調(diào)控lamin B1表達(dá)［17］，而P53是neddylation修飾的底物［18］。我們推測neddylation修飾可能通過P53調(diào)控lamin B1的表達(dá)。首先利用si-P53和si-NC分別轉(zhuǎn)染MCF-7/gNEDD8細(xì)胞和MCF-7/con細(xì)胞以沉默P53表達(dá)，Western blot方法檢測P53及l(fā)amin B1表達(dá)變化。結(jié)果顯示，敲低NEDD8表達(dá)以阻斷neddylation修飾后，P53蛋白發(fā)生了積聚（圖4A）。沉默P53部分逆轉(zhuǎn)了阻斷neddylation修飾對(duì)lamin B1的抑制（圖4B）。以上結(jié)果提示，neddylation修飾可能通過P53依賴的方式調(diào)控lamin B1表達(dá)。

圖4 Neddylation修飾通過P53依賴的方式調(diào)控lamin B1表達(dá)Fig.4 Neddylation modification regulated lamin B1 expression in P53-denendent manner

2.5 Lamin B1高表達(dá)在乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值

我們前期研究發(fā)現(xiàn)neddylation過度活化患者預(yù)后較差［9］。考慮到neddylation修飾對(duì)lamin B1的調(diào)控作用，lamin B1在乳腺癌中的預(yù)后作用顯得尤為重要。目前對(duì)于lamin B1的預(yù)后價(jià)值仍有爭議。我們利用Kaplan-Meier Plotter在線預(yù)后分析網(wǎng)站（https://kmplot.com）進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lamin B1高表達(dá)與患者較差的無進(jìn)展生存時(shí)間（progression-free survival，PFS）（圖5A）和總生存時(shí)間（overall survival，OS）（圖5B）呈正相關(guān)，提示lamin B1高表達(dá)患者預(yù)后較差。

圖5 Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析Lamin B1表達(dá)對(duì)PFS和OS的影響Fig.5 The effect of lamin B1 expressions on PFS and OS were analyzed using Kaplan-Meier Plotter dataset

3 討 論

本研究利用乳腺癌組織芯片免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)neddylation修飾與lamin B1表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)阻斷neddylation修飾可抑制lamin B1表達(dá)，沉默P53表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)阻斷neddylation修飾對(duì)lamin B1的抑制。由此我們得出初步結(jié)果，neddylation修飾通過P53依賴的方式調(diào)控lamin B1的表達(dá)。

關(guān)于neddylation修飾與lamin B1之間的關(guān)系，目前未見研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)neddylation修飾與lmain B1表達(dá)呈顯著正相關(guān)，彌補(bǔ)了之前研究的空白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)neddylation修飾在乳腺癌中過度活化并提示較差預(yù)后［9］。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，neddylation修飾調(diào)控lamin B1表達(dá)，lamin B1高表達(dá)提示患者較差預(yù)后。Neddylation修飾和lamin B1結(jié)合傳統(tǒng)的預(yù)后因子可能為乳腺癌提供更加敏感和精確的預(yù)后模型。關(guān)于Lamin B1在乳腺癌中的預(yù)后預(yù)測價(jià)值及兩者的結(jié)合是否能夠提供更好的預(yù)測模型，尚待進(jìn)一步的研究。

靶向neddylation修飾可作為一種潛在的腫瘤治療方法。MLN4924作為一種小分子neddylation抑制劑，已進(jìn)入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，并取得了不錯(cuò)的結(jié)果，證明了其較好的安全性和有效性［19］。lamin B1作為核被膜的主要組成成分，維持細(xì)胞核的形狀和結(jié)構(gòu)［11］。lamin B1表達(dá)缺失可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖［16］。本研究發(fā)現(xiàn)阻斷neddylation修飾抑制lamin B1表達(dá)，據(jù)此推測neddylation修飾可能通過lamin B1發(fā)揮作用，進(jìn)一步我們證實(shí)neddylation修飾通過P53調(diào)控lamin B1表達(dá)。lamin B1可能作為乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)，并明確neddylation修飾如何通過P53調(diào)控lamin B1表達(dá)。

本研究存在一定的局限性。首先，對(duì)于lamin B1的檢測，以往的研究多采用免疫組織化學(xué)法，也有研究者采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）的方法進(jìn)行分析。本研究采用的是免疫組織化學(xué)法，存在一定的偏倚。其次，研究的樣本量較小，可能會(huì)使結(jié)果的可信度下降。未來將增加樣本量，繼續(xù)深入研究。

本研究的結(jié)果表明，neddylation修飾調(diào)控lamin B1表達(dá)?；趎eddylation修飾及l(fā)amin B1也許可以建立更好的乳腺癌預(yù)后預(yù)測模型，需要進(jìn)一步的前瞻性研究加以證實(shí)。Lamin B1可能作為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。