楊若渠，霍芃呈，胡琮佼，施明妍，羅禮君

牙周炎是一種以牙齦炎癥、牙周支持組織破壞為特征的慢性炎癥性疾病，其中重度牙周炎在全球范圍內(nèi)患病率約為11.2%[1]，波及數(shù)億人口。Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者存在更多的牙齒缺失甚至牙列缺失的可能[2]。除了清除牙周致病微生物，控制其在牙周袋和口腔其他部位定植引起的再感染也非常重要[3]。因此，歐洲牙周病學(xué)聯(lián)合會EFP和美國牙周病學(xué)會AAP聯(lián)合建議，輔助應(yīng)用抗生素可能有助于消除或抑制病原微生物，改善機械治療的臨床療效[4]。

本研究旨在通過全身應(yīng)用阿奇霉素(azithromycin，AZI)輔助Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者非手術(shù)治療，通過臨床檢查和16S rRNA的高通量測序，比較常規(guī)齦下刮治及根面平整(scaling and root planing，SRP)和SRP聯(lián)合AZI的臨床療效及治療對唾液微生物群落的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料和分組

本研究獲得同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2017-WJW-5)。樣本量計算(R語言3.4.3，http://www.r-project.org)表明：根據(jù)以往文獻，AZI組較SRP組探診深度(probing depth，PD)改善按1 mm計算，則每個治療組中需要的病例數(shù)需達到22例左右(90%置信區(qū)間，P<0.01)?？紤]到患者失訪等情況，每組納入27例患者。選擇2019年9月至2020年8月在同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科就診的牙周炎患者54例(最終完成研究方案者40例)。由SPSS 27.0軟件(IBM，Armonk，NY，美國)生成隨機列表，將所有患者隨機分配至AZI輔助非手術(shù)治療組(AZI組)和常規(guī)非手術(shù)治療組(SRP組)(圖1)。

圖1 研究流程圖

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)2018年AAP和EFP提出的標(biāo)準(zhǔn)進行牙周炎診斷[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①年齡18～65歲；②口內(nèi)牙齒數(shù)目至少20顆；③最大鄰面臨床附著喪失(clinical attachment loss，CAL)≥5 mm；④影像學(xué)骨損失擴展到牙根的中三分之一及以上。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①有可能影響牙周狀況的全身性疾病或其他狀況；②有AZI過敏史或疑似過敏；③口內(nèi)有正畸裝置、延長或懸垂的修復(fù)體等；④妊娠期或哺乳期女性；⑤需要抗生素預(yù)防給藥；⑥在研究開始前6個月內(nèi)使用過抗生素、抗炎藥；⑦定期使用化學(xué)制劑用于抗菌斑、抗齦炎治療；⑧在研究開始前6個月內(nèi)接受過牙周治療；⑨不愿意參加隨訪。

1.3 實驗設(shè)計

基線臨床檢查后，SRP組和AZI組患者均行全口SRP。AZI組患者在臨床治療后當(dāng)天開始服用AZI，500 mg/d，連續(xù)3 d。在基線、SRP后第3天和第6周記錄患者的牙周臨床指標(biāo)，收集唾液樣本。

1.4 臨床評估

在基線、牙周治療后第3天和第6周進行臨床評估，使用Florida探針對口內(nèi)所有牙齒(第三磨牙除外)的6個牙周位點進行PD和CAL測量，記錄探診出血(bleeding on probing，BOP)情況。為減少技術(shù)差異，臨床檢查和治療由兩名經(jīng)驗豐富的牙周醫(yī)生分別進行。檢查者對實驗不知情，檢查者可重復(fù)性優(yōu)(Kappa系數(shù)>0.85)。

1.5 唾液微生物群落多樣性分析

1.5.1 樣本DNA提取擴增 在基線、牙周治療后第3天和第6周采集非刺激性唾液樣本，儲存于-20 ℃。使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences，美國)從唾液樣本中提取微生物群落基因組DNA并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。用NanoDrop 2000紫外可見分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國)測定DNA濃度和純度。通過ABI GeneAmp?9700 PCR熱循環(huán)儀(Applied Biosystems，美國)，用引物對338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌16S rRNA基因的高變區(qū)(V3-V4)。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃單延伸10 min，4 ℃終止，共27個循環(huán)。反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液(4 μL)、2.5 mmol/L dNTP(2 μL)、正向引物(5 μmol/L)、反向引物(5 μmol/L)、TransStart FastPfu DNA聚合酶(0.4 μL)、模板DNA(10 ng)和ddH2O(補足至20 μL)。PCR反應(yīng)重復(fù)3次。PCR產(chǎn)物從2%瓊脂糖凝膠中提取后，經(jīng)AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒純化，使用QuantusTM熒光計(Promega，美國)定量檢測。

1.5.2 Illumina MiSeq測序 按上海美吉生物公司的標(biāo)準(zhǔn)，在Illumina MiSeq平臺(Illumina，美國)上將純化擴增子進行配對末端測序。

測序數(shù)據(jù)處理：將16S rRNA基因測序原始讀段解復(fù)用，經(jīng)Trimmomatic質(zhì)量過濾后由FLASH合并。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下：①300 bp讀段經(jīng)50 bp滑動窗口質(zhì)控，若平均質(zhì)量評分<20則截斷，去除短于50 bp的截斷讀段、字符模糊的讀段；②組裝重疊序列長于10 bp的序列，去除無法組裝的序列，重疊區(qū)的最大錯配率為0.2；③按barcode和引物區(qū)分樣本，調(diào)整序列方向。使用UPARSE(版本7.1，http://drive5.com/uparse/)按97%的相似閾值將操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)歸類，并去除嵌合序列[6]，應(yīng)用RDP分類器(RDP classifier，http://rdp.cme.msu.edu/)按0.70的置信閾值與16S rRNA數(shù)據(jù)庫比對(Silva SSU128)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 27.0軟件比較分析兩組的臨床參數(shù)。在各時間點計算每例受試者PD、CAL和BOP的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗、卡方檢驗、多因素重復(fù)測量方差分析檢驗組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床評價

共有40例受試者(AZI組、SRP組各20例)完成了研究流程，兩組一般臨床資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 患者特征及基線臨床指標(biāo)

與基線相比，兩組治療后PD和CAL均顯著降低，其改善差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與SRP組相比，AZI組PD在治療后第6周改善更顯著(P<0.05)；在CAL改善方面，AZI組在治療后第3天和第6周均較明顯(P<0.05)(表2)。

表2 治療前后牙周指標(biāo)比較

研究對持續(xù)存在的牙周袋位點進行了分層計數(shù)統(tǒng)計，并根據(jù)PD和CAL的不同深度分為淺位點(<4 mm)、中位點(4～6 mm)和深位點(>6 mm)。位點水平分層結(jié)果顯示：基線時，兩組PD中、深位點數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，SRP組CAL中位點數(shù)較少而深位點數(shù)較多(P<0.05)，兩組其他各類位點及BOP陽性位點占比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。牙周治療后第3天，AZI組PD、CAL改善比SRP組顯著，BOP陰性位點占比均較高(P<0.05)。AZI組治療后第3天PD的中、深位點更少，CAL淺位點占比高于SRP組，而深位點占比低于SRP組(P<0.05)。治療后第6周時，AZI組PD、CAL和BOP陽性位點數(shù)與治療后第3天相比均表現(xiàn)出改善趨勢；且第6周時，與SRP組相比，AZI組PD、CAL淺位點和BOP陰性位點占比均較高，而CAL深位點和BOP陽性位點占比更低(P<0.05)(表3)?？傮w而言，治療后AZI組的位點水平牙周指標(biāo)優(yōu)于SRP組。

表3 治療前后位點水平牙周指標(biāo)的比較

2.2 唾液微生物群落多樣性分析

通過16S rRNA測序分析對兩組唾液樣品中的微生物群落進行表征，確定各分類單元豐富度、多樣性和相對豐度。共檢出26門、57綱、136目、225科、388屬、669種以及1 179個OTU。樣品中微生物群的結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢類群與以往的重度牙周炎研究報道大體相似[7-10]。

2.2.1 α多樣性 通過α多樣性評估樣本微生物群落的物種豐富度和多樣性。測序深度指數(shù)Good′s coverage為99.88%，表明樣本中絕大多數(shù)的細菌被成功測序，大多數(shù)測序樣本的稀釋曲線接近漸近線，表明樣本的測序數(shù)據(jù)量充足。與基線相比，AZI組治療后第3天和第6周的Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)(abundance-based coverage estimator)(代表微生物群落的豐富度)顯著降低(P<0.01)，Shannon指數(shù)(代表群落多樣性)明顯降低(P<0.05)；治療后第3天Shannon均勻度指數(shù)(Shannon evenness index，SEI)(代表群落均勻度)明顯低于基線(P<0.05)。SRP組中僅Sobs指數(shù)在治療后第3天明顯降低(P<0.05)，無其他顯著差異(圖2)。

估計量的Wilcoxon秩和檢驗，*：P<0.05；**：P<0.01

2.2.2 β多樣性 利用層次聚類(hierarchical clustering)確定樣本在聚類分支中的距離，并根據(jù)不同的距離閾值將樣本分為多個內(nèi)聚組。主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)結(jié)果顯示，SRP組和AZI組的細菌群落存在明顯差異：在治療后第3天和第6周，AZI組優(yōu)勢菌群遠離基線區(qū)域的趨勢較為明顯，而SRP組優(yōu)勢菌群的變化并不明顯。表明AZI治療后，唾液微生物群落組成發(fā)生了明顯改變(圖3A)。非度量多維尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling，NMDS)的結(jié)果與此相似(圖3B)。

A：OTU水平主坐標(biāo)分析；B：OTU水平非度量多維尺度分析

2.2.3 菌群分型數(shù)據(jù)分析 根據(jù)目水平的細菌豐度計算Jensen-Shannon分歧度，使用PAM算法聚類，并繪制PCoA圖。根據(jù)聚類結(jié)果，分析各組優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)，樣本口腔菌群聚類為兩種類型，按所占比例最高的菌目命名：一類為擬桿菌型，另一類為乳桿菌型。治療后第3天和第6周，乳桿菌型所占比例兩組均有增加，且AZI組更為明顯(圖4)。

A:目水平分型分析；B:分型分析柱狀圖

2.2.4 屬水平物種組成比較 治療后第3天，AZI組唾液樣本中密螺旋體(Treponema)(P<0.001)、梭桿菌(Fusobacterium)和卟啉單胞菌(Porphyromonas)的占比明顯降低(P<0.05)，而普雷沃菌(Prevotella)占比增加(P<0.05)；治療后第6周，梭桿菌(P<0.05)和密螺旋體(P<0.001)構(gòu)成比進一步降低，而此時，普雷沃菌構(gòu)成比回落、卟啉單胞菌構(gòu)成比有所上升，兩者構(gòu)成比均接近基線水平(圖5B)。治療前后SRP組菌群組成變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5A)。

A：SRP組各時間點物種組成構(gòu)成比；B：AZI組各時間點物種組成構(gòu)成比；*：P<0.05，**：P<0.01

3 討 論

重度牙周炎可應(yīng)用全身抗生素輔助治療，如阿莫西林聯(lián)合甲硝唑或者單獨使用AZI。AZI是第二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對牙周病原體有強效殺菌活性[11-12]，且不良反應(yīng)發(fā)生率低，作用持久[13]，同時還有免疫調(diào)節(jié)作用[14]，可以縮短治療時間，確保良好的患者依從性[15]。有研究顯示，AZI聯(lián)合基礎(chǔ)治療的療效優(yōu)于常規(guī)基礎(chǔ)治療，對深牙周袋位點炎癥改善明顯[16-18]。Nakajima等[19]認為基礎(chǔ)治療后連續(xù)3 d維持用量500 mg/d，對牙周疾病有效。有研究證明，在基礎(chǔ)治療后口服AZI 3 d的效果與口服阿莫西林或甲硝唑7 d的效果相同[20]。但也有學(xué)者認為，與SRP或SRP聯(lián)合氯己定相比，AZI對牙周致病菌無明顯影響[21-24]。因此，AZI輔助牙周非手術(shù)治療的臨床效果尚需進一步明確。

非手術(shù)治療是牙周炎治療的核心，現(xiàn)有的大量研究比較了各類抗生素輔助SRP治療方案，以期減少牙周炎致病菌和相關(guān)組織損傷。本研究評估了常規(guī)SRP和SRP聯(lián)合AZI兩種治療方案對Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者牙周非手術(shù)治療的短期臨床獲益及對唾液微生物群落的影響。

在臨床獲益方面，本研究顯示，治療6周后，兩組臨床指標(biāo)較基線均有明顯改善。與SRP組相比，AZI組PD改善更顯著。而在CAL及BOP改善方面，AZI組在治療后第3天和第6周均較明顯。AZI組深位點的PD、CAL改善較SRP組更明顯，提示AZI對牙周袋深位點有效，這與Zhang等[18]和O′Rourke[25]Meta分析研究的結(jié)果一致，但Saleh等[26]的研究發(fā)現(xiàn)：無論是SRP聯(lián)合AZI組，還是阿莫西林+甲硝唑(A+M)聯(lián)合SRP組，與常規(guī)SRP組相比，對牙周深位點的治療效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與不同研究的樣本量大小、受試對象差異等多種因素有關(guān)。

口腔中有700多種細菌、真菌、病毒、古細菌和原生動物[27]，但只有少數(shù)病原菌可在一定條件下釋放毒力因子干擾宿主防御機制，損傷牙周組織。正常情況下，口腔微生物菌落維持相對穩(wěn)定的微環(huán)境。當(dāng)平衡被破壞，機體則可能出現(xiàn)病變[28-29]。人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(the human oral microbiome database，HOMD)根據(jù)全長16S rRNA基因序列描述了750多個口腔分類群，可用于分析微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。

以往研究多采用齦下菌斑代表口腔微生物菌群，但齦下菌斑的采樣要求較高，牙周治療后的菌斑采集量有限，可能會影響數(shù)據(jù)分析的效度。研究表明，牙周病原體在齦下菌斑樣本和唾液樣本中的檢出呈正相關(guān)[30]，兩種樣本的病原體檢驗效度相近[31]，而且唾液菌斑具有采集方便、重復(fù)性好等優(yōu)點，因此本研究采用唾液采集方案，使用唾液菌群代表口腔微生物群落進行微生物學(xué)分析。

本研究對采集的唾液樣本進行了微生物群落多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AZI組微生物群落的豐富度、均勻度以及多樣性在治療后顯著降低，而SRP組僅豐富度在治療后第3天有所降低。菌群分型數(shù)據(jù)顯示，治療后第3天和第6周，乳桿菌所占比例兩組均有增加，且AZI組更為明顯。這表明AZI治療后，唾液微生物群落組成發(fā)生了明顯改變。屬水平物種組成分析的結(jié)果表明，AZI對牙周紅、橙致病復(fù)合體具有特異性作用。治療后第3天和第6周觀察到梭桿菌和密螺旋體的相對豐度持續(xù)減少；盡管治療AZI組卟啉單胞菌在治療后第3天相對豐度顯著降低，但在治療后第6周出現(xiàn)了一定程度的反彈。研究結(jié)果表明，與常規(guī)SRP相比，AZI作為靶向牙周紅色和橙色致病復(fù)合體的輔助治療可改善臨床和微生物學(xué)參數(shù)。

本研究存在樣本量較小、研究時間跨度較短等局限性，關(guān)于AZI輔助牙周非手術(shù)治療的研究結(jié)論尚不明晰，需要更多多中心、大樣本、更長時間的隨機對照臨床試驗研究以進一步明確其臨床療效。

綜上所述，AZI結(jié)合常規(guī)的牙周非手術(shù)治療，能改善Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者的臨床治療效果，改變其唾液微生物菌群的組成，抑制其牙周紅、橙復(fù)合體中的密螺旋體、梭桿菌和卟啉單胞菌。