劉梅清，段 瑞，孫曉燕，王繼龍, 2，馮曉莉, 2，萬玲娟，魏舒暢, 2*

超濾-固體膜萃取-反萃取技術制備異甘草苷工藝研究

劉梅清1，段 瑞3，孫曉燕1，王繼龍1, 2，馮曉莉1, 2，萬玲娟1，魏舒暢1, 2*

1. 甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000 3. 沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110122

采用固體膜萃取技術制備甘草超濾液中的異甘草苷，以期得到該技術分離異甘草苷的工藝條件。以異甘草苷的萃取和反萃取率為指標，考察膜萃取過程中三相體積流量及反萃取溫度對異甘草苷萃取效果的影響。最佳固體膜萃取條件為甘草超濾液體積流量94 mL/min、萃取劑體積流量188 mL/min、反萃取劑體積流量188 mL/min，反萃取溫度35 ℃。在此條件下，異甘草苷的平均萃取率可達到97.15%，反萃取率達到80.41%，最終異甘草苷的轉移率達到78.12%。作為中藥有效成分分離的一種新型技術，固體膜萃取技術具有高效、簡單、萃取劑可循環(huán)利用等諸多優(yōu)點，可為異甘草苷的分離制備提供一種新的適用技術。

異甘草苷；超濾；固體膜；萃??；反萃??；甘草

甘草為我國傳統(tǒng)常用中藥材，在制藥、食品、化工和印染等方面都有廣泛應用[1]。《中國藥典》2020年版收載的有甘草Fisch.、脹果甘草Bat.和光果甘草L. 3個品種[2]，以甘草分布最廣、產量最高。甘草主要含黃酮、三萜、苯丙素、多糖等類化學成分[3]，其中黃酮類包括黃酮醇、二氫黃酮、異黃酮、查耳酮等化合物及其苷類[4]。異甘草苷屬于查耳酮類化合物，具有抗?jié)?、抗炎[5]、抗氧化[6]、抑制脂質過氧化[7]、抗腫瘤血管新生、解毒[8]等作用。

本課題組前期已經對甘草超濾液中的主要有效成分進行了絡合萃取研究[9-11]，本實驗在此基礎上，進一步利用固體膜萃取技術對甘草超濾液中異甘草苷的分離制備工藝進行了研究。將固體膜萃取技術直接應用于中藥有效成分的分離會導致膜污染。鑒于此，先將甘草水提液進行超濾處理，在目標成分得到有效保留的情況下，可以除去其中大量的水溶性大分子雜質，使料液黏度顯著降低，保證后期膜萃取過程的順利高效進行，膜萃取過程使用的萃取劑可再生循環(huán)利用，得到的目標產品無有機溶劑殘留。該技術操作簡單、適合批量制備。

1 儀器與試藥

Agilent-1100型液相色譜儀，美國Agilgent公司；Hypersil BDS-C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），賽默飛世爾科技有限公司；ABT-100-5M-型分析天平，十萬分之一，德國KERN公司；聚醚砜（PES）膜組件（孔徑0.45 μm），浙江東大水業(yè)集團有限公司；輸送泵，保定蘭格恒流泵有限公司。

三烷基氧化膦（TRPO），質量分數(shù)＞93.0%，溧陽市凱信化工有限公司；磺化煤油（260#），廣東正茂石化有限公司；乙腈為色譜純，氫氧化鈉、磷酸為分析純、水為超純水。

甘草飲片購于蘭州市黃河藥材市場，經甘肅中醫(yī)藥大學藥學院魏舒暢教授鑒定為豆科植物甘草Fisch.的干燥根及根莖；對照品異甘草苷（批號5041-81-6）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，質量分數(shù)≥98%，供藥品檢驗用。

2 方法與結果

2.1 甘草的提取、超濾工藝

取甘草飲片，用24倍量稀氨水回流提取3次，每次1 h，提取液用10 nm無機陶瓷膜超濾，得甘草超濾液，將超濾液濃縮至含生藥1 g/mL，備用[12]。

2.2 串級固體膜萃取-反萃取方法

取甘草超濾液（稀釋至0.05 g/mL）3000 mL、萃取劑13% TRPO＋87%磺化煤油1000 mL、反萃取劑0.26% NaOH水溶液3000 mL，置于相應的儲液罐中，按照圖1固體膜萃取-反萃取實驗裝置進行實驗操作：設置3個泵的體積流量，實驗開始后，將超濾液和反萃取劑注入膜組件的管程，萃取劑注入殼程，待甘草超濾液、萃取劑、反萃取劑3相體系均運行穩(wěn)定后，開始記錄萃取-反萃取時間，分別在不同時間點取樣，甘草超濾液經萃取后為萃余液，測定不同時間點萃余液和反萃取液中異甘草苷的質量濃度。

圖1 固體膜萃取-反萃取實驗裝置流程圖

2.3 異甘草苷的含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取異甘草苷對照品適量，加70%乙醇制成質量濃度為8.24 μg/mL的對照品溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 準確量取0.05 g/mL的甘草超濾液、固體膜絡合萃取后的萃余液、反萃取液各1 mL于25 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Hypersil BDS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.05%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～100%乙腈；36～40 min，100%～19%乙腈；檢測波長為360 nm；柱溫26 ℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL；理論塔板數(shù)按異甘草苷峰計算不低于 30 000。色譜圖見圖2。

2.3.4 線性關系考察 分別精密吸取異甘草苷對照品溶液0.5、1、5、7、9、15 mL，置25 mL量瓶中，用70%乙醇定容并搖勻，精密吸取上述各對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測定。以峰面積值為縱坐標（），進樣量為橫坐標（）進行線性回歸，得回歸方程為＝3 974.9＋0.246 6，＝0.999 9，線性范圍為0.082 0～74.044 5 μg。

2.3.5 精密度試驗 精密量取異甘草苷對照品溶液適量，按“2.3.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。結果異甘草苷峰面積的RSD為1.31%，表明儀器精密度良好。

A-異甘草苷對照品 B-甘草超濾液 C-固體膜萃余液 D-固體膜反萃取液

2.3.6 重復性試驗 按“2.3.2”項下方法平行制備6份反萃取液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定。結果異甘草苷質量濃度的RSD為1.98%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、24 h進樣測定。結果異甘草苷峰面積的RSD為1.47%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取同一批已測定異甘草苷含量的反萃取液6份，每份精密量取10 mL，分別加入異甘草苷對照品溶液1.5 mL，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果異甘草苷的平均加樣回收率為101.46%，其RSD為1.83%，表明該方法的準確度較好。

2.4 萃取率及反萃取率的計算

按照以下公式分別計算異甘草苷的萃取率和反萃取率。

萃取率＝(超濾液中異甘草苷的質量濃度－萃余液中異甘草苷的質量濃度)/超濾液中異甘草苷的質量濃度

反萃取率＝反萃取液中異甘草苷的質量濃度/(超濾液中異甘草苷的質量濃度－萃余液中異甘草苷的質量濃度)

2.5 串級膜萃取過程中不同因素對異甘草苷萃取率及反萃取率的影響

2.5.1 甘草超濾液、萃取劑、反萃取劑3相體積流量對異甘草苷萃取率及反萃取率的影響 考察甘草超濾液、萃取劑、反萃取劑3相體積流量對甘草超濾液中異甘草苷萃取及反萃取率的影響，實驗運行36 h后取樣，測定樣品中異甘草苷的含量，并按照“2.4”項下公式計算異甘草苷的萃取率和反萃取率，結果見表1。膜萃取過程中甘草超濾液與萃取劑的體積流量對異甘草苷的萃取率有影響，萃取劑與反萃取劑的體積流量對異甘草苷的反萃取率無影響。

表1 3相體積流量對異甘草苷萃取率及反萃取率的影響

異甘草苷的萃取率隨著甘草超濾液體積流量的減小而增大，隨著萃取劑體積流量的增大而增大，故本實驗初步選擇串級固體膜萃取反萃取異甘草苷時3相體積流量為甘草超濾液94 mL/min、萃取劑188 mL/min、反萃取劑188 mL/min，在此條件下實驗36 h后，異甘草苷的萃取率為97.82%，反萃取率為62.06%。

2.5.2 反萃取溫度對異甘草苷反萃取率的影響 從前面實驗結果可知，異甘草苷反萃取率較低，有研究表明，反萃取過程為吸熱過程[13]，升高反萃取過程的溫度能提高反萃取率?？紤]到后期工業(yè)化操作及經濟效益問題，本實驗水浴加熱反萃取劑不超過35 ℃，甘草超濾液體積流量為94 mL/min；萃取劑體積流量為188 mL/min；反萃取劑體積流量為188 mL/min，在此條件下分別考察了反萃取劑溫度在25、35 ℃時異甘草苷的反萃取率隨時間的變化。結果見表2。由表2結果可知，隨著時間的延長，反萃取率在不斷的增大，將反萃取劑儲液罐置于水浴鍋中，在設定溫度下操作并保持不變，35 ℃時異甘草苷的反萃取率明顯高于25 ℃，35 ℃條件下，膜反萃取36 h后，異甘草苷的反萃取率為80.37%，故本實驗選擇反萃取過程中的溫度為35 ℃。

表2 反萃取溫度對異甘草苷的反萃取率的影響

2.6 串級固體膜萃取反萃取異甘草苷的工藝條件驗證

取同一批甘草超濾液3份，每份0.05 g/mL甘草超濾液3000 mL與13% TRPO＋87%磺化煤油1000 mL、0.26% NaOH水溶液3000 mL進行串級固體膜萃取及反萃取實驗。將配制好的3相溶液置相應的儲液罐中，甘草超濾液體積流量為94 mL/min、萃取劑體積流量為188 mL/min、反萃取劑體積流量為188 mL/min，并將反萃取劑儲液罐置于水浴鍋中保持35 ℃不變，按照固體膜萃取方法進行操作，實驗運行時間為36 h，HPLC法測定樣品中異甘草苷的含量，結果見表3，RSD均小于3%，說明該工藝重復性較好。

表3 工藝條件驗證試驗結果

2.7 萃取劑的循環(huán)利用對異甘草苷萃取效果的影響

萃取劑的循環(huán)使用可以在很大程度上節(jié)約成本，減小環(huán)境污染，已經使用過的萃取劑還是有少量黃酮類物質殘留，故將已經使用的萃取劑再生循環(huán)利用。

2.7.1 萃取劑的再生 將已經使用過的萃取劑（13% TRPO＋87%磺化煤油）中加入相同體積的1% NaOH水溶液充分搖勻，然后靜置分層，將分層出來的萃取劑按照相同方法進行再生，重復4次。

2.7.2 再生萃取劑的萃取能力考察 取0.05 g/mL的甘草超濾液10 mL與再生的萃取劑10 mL（該萃取劑已經循環(huán)使用3次）加入60 mL離心管中，密封并置于旋轉混勻儀上于室溫下萃?。?5 r/min）30 min后，3000 r/min離心，取下層萃余液測異甘草苷的含量，考察再生萃取劑的萃取能力，結果見表4。萃取劑循環(huán)使用時異甘草苷的萃取率可達到98.01%，再生后的萃取劑萃取能力有所提高，是因為前期萃取劑中異甘草苷未萃取完全，經過再次絡合萃取，異甘草苷被萃取出來，該結果表明，絡合萃取后的萃取劑可循環(huán)使用，降低生產成本。

表4 再生萃取劑的萃取能力考察結果

3 討論

膜萃取過程機制是建立在溶劑萃取或絡合萃取機制之上的，即物理萃取和化學萃取[14]。膜的最大的作用是提供更大的傳質比表面積，其傳質過程發(fā)生在由料液相和充滿膜孔的溶劑相所形成的界面層上，該傳質過程不存在傳統(tǒng)液液萃取過程中的液滴的分散和聚合現(xiàn)象[15]。其中膜萃取中溶質的傳質過程可為以下幾個步驟：（1）溶質由水相主體擴散至水相邊界層；（2）溶質由水相邊界層擴散至水相-有機相界面并與萃取劑發(fā)生反應，生成萃合物；（3）萃合物由膜相主體擴散至溶劑相主體。目前膜萃取技術主要用于工業(yè)廢水的凈化，回收廢水中的酚類、苯胺類等有機化合物和金屬[16-17]，而將該技術用于分離純化中藥提取液中的有效成分還未有報道。本實驗使用中空纖維膜將萃取劑與甘草超濾液和反萃取液隔離開，在保證相與相之間不直接接觸的條件下，萃取及反萃取過程在中空纖維膜的表面的微孔中進行，該技術既分離純化得到了目標物質，還使得萃取劑循環(huán)使用，很大程度上節(jié)約了成本。

本實驗在串級固體膜萃取及反萃取異甘草苷過程中發(fā)現(xiàn)，膜萃取12 h后異甘草苷的平均萃取率就能達到97.15%，繼續(xù)增加萃取時間異甘草苷萃取率保持不變，但是膜反萃取36 h后，異甘草苷的平均反萃取率僅能達到80.41%，而在課題組前期絡合萃取異甘草苷實驗中萃取15 min時異甘草苷的萃取率就能達到97.60%，反萃取率能達到95.40%[10]。導致目標物質在膜萃取實驗中萃取及反萃取時間比較長的原因可能是：實驗所用膜組件的中空纖維膜壁太厚、萃取傳質阻力太大，后期將通過改進膜組件以期獲得更高的萃取效率；其次推斷導致異甘草苷的萃取率及反萃取率存在差異的原因可能是：在絡合反應過程中反應速度的不同形成的絡合物的牢固程度不同，進而導致絡合物解離速度不一樣，故形成的絡合物轉移至反萃取劑中的速度不同，其反應機制將在后續(xù)研究中進行。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 李娜, 張晨, 鐘贛生, 等. 不同品種甘草化學成分、藥理作用的研究進展及質量標志物(Q-Marker)預測分析 [J]. 中草藥, 2021, 52(24): 7680-7692.

[2] 中國藥典[S].一部. 2020: 88.

[3] 劉剛, 吳燕, 劉育辰, 等. 烏拉爾甘草化學成分研究進展 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2021, 23(11): 2006-2016.

[4] 李娜, 張晨, 鐘贛生, 等. 不同品種甘草化學成分、藥理作用的研究進展及質量標志物（Q-Marker）預測分析[J]. 中草藥, 2021, 52(24): 7680-7692.

[5] 趙艷敏, 劉素香, 張晨曦, 等. 基于HPLC-Q-TOF-MS技術的甘草化學成分分析 [J]. 中草藥, 2016, 47(12): 2061-2068.

[6] 周姍, 袁伯川, 楊瑞, 等. HPLC法分析12產地甘草中4種主要黃酮類化合物的含量 [J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2017, 35(8): 1943-1947.

[7] 韋悅, 程娟娟, 程雪梅, 等. 維吾爾藥復方木尼孜其顆粒劑的質量控制方法研究 [J]. 藥物分析雜志, 2017, 37(10): 1799-1809.

[8] 任明, 許真真. HPLC-UV切換波長法同時測定復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸 [J]. 山東醫(yī)藥, 2016, 56(11): 35-37.

[9] 石盤棋, 劉曉霞, 魏舒暢, 等. 絡合萃取-反萃法制備異甘草素的工藝研究 [J]. 高?；瘜W工程學報, 2020, 34(4): 939-945.

[10] 孫曉燕, 王繼龍, 劉曉霞, 等. 絡合萃取異甘草苷的工藝條件研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(20): 4920-4924.

[11] 蒲紅利, 周博, 魏舒暢, 等. 甘草超濾液中甘草酸的絡合萃取研究 [J]. 食品工業(yè)科技, 2019, 40(6): 157-160.

[12] 周博, 蒲紅利, 王繼龍, 等. 基于超濾-絡合萃取技術的甘草酸制備工藝研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(6): 1323-1327.

[13] 戴猷元, 秦煒, 張瑾. 有機物絡合萃取化學 [M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2008: 20.

[14] 張楠. 中空纖維支撐液膜法回收制藥廢水中7-ACA的過程研究[D]. 天津: 天津大學, 2016.

[15] 戴猷元. 新型萃取分離技術的發(fā)展及應用 [M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2007: 182.

[16] 段作山. PVDF中空纖維膜萃取處理煤氣化含酚廢水 [D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業(yè)大學, 2010.

[17] 姜名珊. MOFs混合基質膜萃取技術—高效液相色譜法分析環(huán)境中有機污染物 [D]. 青島: 青島理工大學, 2019.

Preparation of isoglycyrrhizin by ultrafiltration and solid membrane extraction and reverse extraction

LIU Mei-qing, DUAN Rui3, SUN Xiao-yan1, WANG Ji-long1, 2, FENG Xiao-li1, 2, WAN Ling-juan1, WEI Shu- chang1, 2

1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Gansu Pharmaceutical Engineering Research Center of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 3. Shenyang Institute of Food and Drug Control, Shenyang 110122, China

To prepare isoglycyrrhizin from Gancao (et, GRR) ultrafiltrate by solid membrane extraction technology, and obtain the technological conditions for the separation of isoglycyrrhizin.The effects of three phase flow rate and reverse extraction temperature on the extraction efficiency of isoglycyrrhizin were investigated with the extraction and reverse extraction rates of isoglycyrrhizin as indexes.The optimal extraction conditions were as follows: flow rate of GRR ultrafiltrate was 94 mL/min, flow rate of extractant was 188 mL/min, flow rate of reverse extractant was 188 mL/min, and temperature of reverse extractant was 35 ℃. Under these conditions, the average extraction rate of isoglycyrrhizin was 97.15% and the reverse extraction rate was 80.41%, finally, the transfer rate of isoglycyrrhizin reached 78.12%.As a new technology for the separation of the active components of traditional Chinese medicine, solid membrane extraction has many advantages, such as high efficiency, simplicity and recyclable extractant, which can provide a new suitable technology for the separation and preparation of isoglycyrrhizin.

isoglycyrrhizin; ultrafiltration; solid membrane; extraction; reverse extraction;et

R283.6

A

0253 - 2670(2022)15 - 4673 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.010

2022-01-24

國家自然科學基金資助項目（82060721）；甘肅省教育廳“雙一流”科研重點項目（GSSYLXM-05）

劉梅清，女，碩士研究生，從事中藥制劑工藝研究。Tel: 18215106395 E-mail: 1489594688@qq.com

通信作者：魏舒暢（1969—），男，教授，博士生導師，從事中藥制劑工藝研究。Tel: 13893467387 E-mail: wshch006@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]