肖 祥，吳宣諭

胰腺癌“炎-癌”轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因篩選及干預(yù)中藥的預(yù)測(cè)分析

肖 祥，吳宣諭*

成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072

通過生物信息學(xué)技術(shù)篩選胰腺癌（pancreatic cancer）與慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）組織的差異基因，預(yù)測(cè)能夠干預(yù)胰腺癌“炎-癌”轉(zhuǎn)化進(jìn)程的中藥及其潛在治療靶點(diǎn)及機(jī)制。從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）獲取GSE151945、GSE30134基因芯片，應(yīng)用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選，并進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析；通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，應(yīng)用CytoHubba插件篩選關(guān)鍵基因；使用R軟件對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析，篩選顯著影響胰腺癌預(yù)后的基因，通過Kaplan-Meier曲線進(jìn)行可視化展示；將上述基因與Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)相互映射，預(yù)測(cè)潛在治療作用的中藥。從TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)獲取中藥化學(xué)成分，利用Cytoscape構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并使用CytoHubba插件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。共篩選出178個(gè)DEGs，其中88個(gè)上調(diào)基因，90個(gè)下調(diào)基因；DEGs主要參與病毒生命周期、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、染色質(zhì)的共價(jià)修飾等生物功能；KEGG通路分析顯示DEGs主要富集在人乳頭瘤病毒感染、志賀菌病、亨廷頓病、癌癥蛋白多糖和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路；共得出20個(gè)關(guān)鍵基因，生存分析提示黏附連接相關(guān)蛋白紐蛋白（vinculin，）、核不均一性核糖核蛋白L（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，L）、小泛素樣修飾物3（small ubiquitin like modifier 3，）、整合素α3（integrin subunit alpha 3，）、整合素β5（integrin subunit beta 5，）、黏結(jié)蛋白聚糖1（syndecan 1，）和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，）顯著影響胰腺癌預(yù)后；篩選得到干預(yù)胰腺癌“炎-癌”轉(zhuǎn)化進(jìn)程的潛在中藥有夏枯草、金錢草、紫蘇、生地、赤芍、菟絲子等。胰腺癌“炎-癌”轉(zhuǎn)化機(jī)制復(fù)雜，中藥可通過多靶點(diǎn)干預(yù)胰腺癌“炎-癌”轉(zhuǎn)化，該研究將為胰腺癌發(fā)生機(jī)制和治療藥物的研究提供參考方向。

慢性胰腺炎；胰腺癌；生物信息學(xué)；中藥預(yù)測(cè)；夏枯草；金錢草；紫蘇；生地黃；赤芍；菟絲子

胰腺癌（pancreatic cancer）是由于胰腺內(nèi)細(xì)胞發(fā)生DNA的異常突變引起細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)失控從而形成的腫瘤，是惡性程度最大的腫瘤之一[1]。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)報(bào)道，胰腺癌的病死率位于所有惡性腫瘤的第7位[2]。我國(guó)胰腺癌的發(fā)病率位于所有惡性腫瘤的第10位，而其病死率位于第6位[3]。胰腺癌的危險(xiǎn)因素包括遺傳、衰老、吸煙、飲酒、肥胖、飲食以及慢性胰腺炎[4]。其中慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是胰腺癌的重要危險(xiǎn)因素之一，這對(duì)胰腺癌的預(yù)防和早期干預(yù)提供了一定的思路，國(guó)際胰腺癌病例與對(duì)照聯(lián)盟指出預(yù)防CP有助于避免胰腺癌的發(fā)生[5]?，F(xiàn)有研究表明CP主要通過內(nèi)源性和外源性途徑引起胰腺癌的發(fā)生，其機(jī)制可能與胰腺纖維化有關(guān)[6-7]，其中、、、、和等基因的異常表達(dá)可能促進(jìn)由CP向胰腺癌的進(jìn)展[8-13]，但其具體機(jī)制仍不清楚。因此，深入探索胰腺癌“炎-癌”轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因和重要生物途徑，對(duì)于胰腺癌的預(yù)防、早期診斷和靶向治療具有重要意義。

隨著社會(huì)對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重視度的提高，生物信息學(xué)技術(shù)憑借其高通量數(shù)據(jù)處理優(yōu)勢(shì)而受到廣泛運(yùn)用[14]。關(guān)于治療胰腺癌新藥的研究仍是當(dāng)下的熱點(diǎn)話題[15]，具有數(shù)千年歷史的中醫(yī)藥，對(duì)于胰腺癌的防治具有一定優(yōu)勢(shì)[16-18]。本研究基于生物信息學(xué)探索胰腺癌“炎-癌”發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因，并對(duì)其展開進(jìn)一步研究，探索其對(duì)于胰腺癌生存率的影響，進(jìn)一步預(yù)測(cè)治療胰腺癌的潛在中藥，并構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，揭示其作用機(jī)制，以期為胰腺癌的臨床診治提供新的思路和方向。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)下載包含胰腺癌與CP患者的基因芯片（GSE151945、GSE30134）數(shù)據(jù)，下載數(shù)據(jù)格式為MINiML。其中GSE151945芯片包括胰腺癌組織3例，CP組織3例，GSE30134芯片包括胰腺癌組織15例，CP組織8例。2種芯片平臺(tái)分別來自GPL17077、GPL3985，種屬為“homo sapiens”。

1.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

采用R 3.40.2軟件preprocessCore軟件包中的normalize.quantiles函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，將探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為gene symbol，剔除有多個(gè)基因的探針，計(jì)算多個(gè)探針對(duì)應(yīng)基因的平均值。提取2個(gè)數(shù)據(jù)集共有g(shù)ene symbol。不同數(shù)據(jù)集標(biāo)記為不同批次，采用R軟件limma包中的removeBatchEffect函數(shù)去除批次效應(yīng)，針對(duì)數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果，通過箱線圖評(píng)估數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化情況；通過對(duì)比批次去除前后可視化主成分分析（principal component analysis，PCA）圖評(píng)估數(shù)據(jù)批次效應(yīng)情況，箱線圖和PCA圖分別通過R軟件包ggplot2和ggord繪制。

1.3 差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選

使用R軟件的limma軟件包研究胰腺癌與CP樣本之間mRNA的DEGs。以＜0.05且log2(FC)＞1或log2(FC)＜?1為條件篩選DEGs。FC為差異倍數(shù)，代表2組樣本間表達(dá)量的比值。其中l(wèi)og2(FC)＞1代表基因表達(dá)上調(diào)，log2(FC)＜?1代表基因表達(dá)下調(diào)，表達(dá)熱圖通過R軟件包pheatmap進(jìn)行展示。

1.4 基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

為進(jìn)一步確認(rèn)上述DEGs的潛在功能，進(jìn)行功能豐富分析。GO是一種廣泛使用的工具，用于注釋具有功能的基因，包括分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細(xì)胞成分（cell component，CC）。KEGG可用于分析基因功能以及相關(guān)的高級(jí)基因組功能信息。使用R軟件中的ClusterProfiler程序包進(jìn)行GO及KEGG分析。

1.5 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵基因篩選

將上述DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，物種設(shè)置為“homo sapiens”，選取相互作用得分大于0.4的基因輸入Cytoscape進(jìn)行可視化，用CytoHubba插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中度（degree）值前20個(gè)基因作為CP癌變關(guān)鍵基因。

1.6 關(guān)鍵基因的生存分析

從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集獲得了178個(gè)胰腺癌的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)（第3級(jí)）的原始計(jì)數(shù)和相應(yīng)的臨床信息，通過R軟件survival和survminer軟件包對(duì)20個(gè)關(guān)鍵基因與胰腺癌總體生存率（overall survival，OS）和無病生存率（disease free survival，DFS）的相關(guān)性進(jìn)行分析，繪制預(yù)后顯著性差異基因的Kaplan-Meier曲線。

1.7 潛在治療中藥的預(yù)測(cè)

參照贠張君等[19]的研究，將顯著影響胰腺癌預(yù)后的基因?qū)隒oremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)映射出具有潛在干預(yù)作用的中藥，以＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選，若藥物數(shù)量過多，則根據(jù)中醫(yī)藥理論知識(shí)和臨床常用為原則進(jìn)一步篩選[20]。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)生物口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18篩選預(yù)測(cè)中藥的有效成分，提取相應(yīng)成分的作用靶點(diǎn)，TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄的藥物成分通過TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索[21-22]。運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的有效靶點(diǎn)進(jìn)行去重、規(guī)范化，將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，利用CytoHubba插件中degree算法對(duì)排名前25的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選并進(jìn)行可視化處理[21]。

2 結(jié)果

2.1 芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和預(yù)處理結(jié)果

根據(jù)數(shù)據(jù)預(yù)處理方案，得到處理后的數(shù)據(jù)符合預(yù)期要求，見圖1-A；通過對(duì)比批次去除前后可視化PCA圖見圖1-B、C，認(rèn)為數(shù)據(jù)批次去除效應(yīng)良好。

2.2 DEGs篩選

根據(jù)篩選條件，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組和CP組之間有178個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因88個(gè)，下調(diào)基因90個(gè)，DEGs火山圖見圖1-D；下調(diào)和上調(diào)最顯著的前50個(gè)基因表達(dá)熱圖見圖1-E。

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析

使用R軟件的ClusterProfiler程序包，分析上述DEGs的GO功能并富集KEGG通路，見圖2。GO分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要參與病毒生命周期（viral life cycle）、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織（extracellular structure organization）、細(xì)胞外基質(zhì)組織（extracellular matrix organization）等生物功能；下調(diào)基因主要參與組蛋白變性（histone madification）、染色質(zhì)的共價(jià)修飾（covalent chromatin modification）等生物功能。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要富集在人乳頭瘤病毒感染（human papillomavirus infection）、志賀菌?。⊿higellosis）、亨廷頓?。℉untington disease）和癌癥蛋白多糖（proteoglycans in cancer）通路；下調(diào)基因主要富集在絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵DEGs篩選

將上述DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，以TSV文件格式導(dǎo)出數(shù)據(jù)，再導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，見圖3；利用CytoHubba插件，根據(jù)度值降序篩選網(wǎng)絡(luò)圖中相互作用程度較高的前20個(gè)基因作為關(guān)鍵基因，得到胰腺癌和CP的關(guān)鍵基因分別為鈣離子依賴的細(xì)胞黏附素1（cadherin 1，CDH1）、小泛素樣修飾蛋白- E2連接酶I（ubiquitin conjugating enzyme E2 I，UBE2I）、信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、黏附連接相關(guān)蛋白紐蛋白（vinculin，VCL）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B受體2（transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2）、環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1，CREB1）、染色質(zhì)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白4（chromodomain helicase DNA binding protein 4，CHD4）、β-2微球蛋白（beta-2-microglobulin，B2M）、組織抑制劑金屬蛋白酶-1（tissue inhibitor metalloproteinase-1，TIMP-1）、伴侶素包含T復(fù)合蛋白1ε亞基（chaperonin containing TCP1 subunit 5，CCT5）、RAS癌基因家族成員（member RAS oncogene family，RAN）、黏結(jié)蛋白聚糖1（syndecan 1，SDC1）、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，NCAM1）、苯丙氨酰-tRNA合成酶β（phenylalanyl-tRNA synthetase subunit beta，F(xiàn)ARSB）、核不均一性核糖核蛋白L（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，HNRNPL）、溶酶體相關(guān)膜蛋白3（lysosomal-associated membrane protein 3，CD63）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）、小泛素樣修飾物3（small ubiquitin like modifier 3，SUMO3）、整合素α3（integrin subunit alpha 3，ITGA3）、整合素β5（integrin subunit beta 5，ITGB5）。其中、、、、、、、、、、、、、為上調(diào)基因；、、、、、為下調(diào)基因。

A-數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后箱線圖 B-去批次前PCA圖 C-去批次后PCA圖 D-DEGs火山圖 E-下調(diào)和上調(diào)最顯著的前50個(gè)基因表達(dá)熱圖

2.5 關(guān)鍵基因的生存分析

對(duì)上述關(guān)鍵基因與胰腺癌的OS和DFS的相關(guān)性進(jìn)行分析，以下7個(gè)基因（、、、、、和）顯著影響胰腺癌預(yù)后。其中、、、、高表達(dá)為OS的危險(xiǎn)因素，高表達(dá)為OS的保護(hù)因素；、、、高表達(dá)為DFS的危險(xiǎn)因素。上述基因?qū)σ认侔┗颊逴S的Kaplan-Meier曲線見圖4，對(duì)胰腺癌患者DFS的Kaplan-Meier曲線見圖5。

圖2 GO富集分析與KEGG通路富集分析

2.6 潛在治療中藥的預(yù)測(cè)

將以上7個(gè)基因與Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)映射，以＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，得到潛在治療中藥，見表1。基于中醫(yī)藥理論分析，夏枯草、金錢草、生地、赤芍具有清熱燥濕、瀉火解毒、活血消癓的功效；紫蘇具有行氣寬中、止嘔的功效；菟絲子補(bǔ)益肝腎，兼走脾經(jīng)，上述藥物在中醫(yī)臨床中常用于CP與胰腺癌的治療，故用于進(jìn)一步分析[23-28]。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取上述6味中藥活性成分和作用靶點(diǎn)，得到85種有效成分，1439個(gè)作用靶點(diǎn)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)上述成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因去重、規(guī)范化，并繪制“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。使用CytoHubba插件degree算法篩選出排列前25的靶點(diǎn)，并以不同色階進(jìn)行展示，上述6味中藥的活性成分主要參與調(diào)控前列腺素氧化環(huán)化酶1（prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1）、前列腺素氧化環(huán)化酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、核受體輔激活因子2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、孕酮受體（progesterone receptor，PGR）等基因，可能成為干預(yù)胰腺癌“炎-癌”發(fā)展過程的潛在中藥，見圖7。

圖3 前20位關(guān)鍵基因編碼蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

3 討論

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，是一種典型的炎癥驅(qū)動(dòng)型癌癥，CP是其主要危險(xiǎn)因素之一[29]。研究表明CP患者群體發(fā)生胰腺癌的概率較一般人群增加2.3～18.5倍，其中遺傳性胰腺炎是已知的最重要的胰腺癌危險(xiǎn)因素[30-31]。最近在歐洲的一項(xiàng)隊(duì)列研究中，581名CP患者在5年隨訪中有6名確診胰腺癌，從診斷CP到胰腺癌發(fā)生的平均時(shí)間為5年[32]。CP癌變具體機(jī)制尚不明了，本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載胰腺癌與CP患者基因芯片，通過R軟件分析DEGs，得到88個(gè)上調(diào)基因，90個(gè)下調(diào)基因。

通過GO和KEGG富集分析對(duì)DEGs進(jìn)行功能注釋，分析其生物學(xué)過程，GO富集分析顯示，上調(diào)基因主要涉及病毒生命周期、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織。溶瘤腺病毒被認(rèn)為是胰腺癌治療的理想療法之一，其具有特異性感染并裂解腫瘤細(xì)胞的作用，具有靶向性好，不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[33]，慢病毒載體在胰腺癌的抗腫瘤研究中廣為運(yùn)用[34]。目前也有研究提出胰腺癌的發(fā)生可能與乙型肝炎病毒（hepatitis B，HBV）感染相關(guān)[35]，且HBV感染者患胰腺癌的可能性增加24%[36]，可能機(jī)制為HBV-X蛋白在胰腺組織內(nèi)表達(dá)并通過磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路促進(jìn)胰腺癌的增殖與轉(zhuǎn)移[37]。因此，上調(diào)基因可能通過調(diào)節(jié)病毒感染介導(dǎo)的通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、增殖與轉(zhuǎn)移。下調(diào)基因主要參與組蛋白變性、染色質(zhì)的共價(jià)修飾。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2D（lysine methyltransferase 2D，KMT2D）下調(diào)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，抑癌基因含有WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶（WW domain containing oxidoreductase，）甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，也是胰腺癌發(fā)生的機(jī)制之一[38-39]。因此，下調(diào)基因可能通過誘導(dǎo)組蛋白變性使DNA構(gòu)象改變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄異常而引起胰腺癌的發(fā)生。

圖4 關(guān)鍵基因?qū)σ认侔㎡S的影響

圖5 關(guān)鍵基因?qū)σ认侔〥FS的影響

表1 關(guān)鍵基因中藥預(yù)測(cè)

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要富集在人乳頭瘤病毒感染、志賀菌病，亨廷頓病和癌癥蛋白多糖通路。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）與全球5.5%的癌癥相關(guān)，HPV感染后基因插入宿主細(xì)胞DNA為其主要機(jī)制，據(jù)報(bào)道，PC的發(fā)生可能與HPV的感染有關(guān)[40-42]。志賀菌是一種革蘭陰性菌，感染后易引起人體出現(xiàn)腹瀉、發(fā)燒、胃部痙攣等癥狀[43]，據(jù)Khodavirdipour等[44]報(bào)道，F(xiàn)lexneri志賀菌在胰腺癌中具有潛在的抗細(xì)胞增殖作用，其可能機(jī)制為上調(diào)Bcl-2-相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）及下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表達(dá)。研究表明，人亨廷頓相互作用蛋白可選擇性表達(dá)于人胰島中，對(duì)胰島分泌功能起著一定的調(diào)節(jié)作用[45-47]。蛋白多糖（proteoglycans, PGs）是一種含有長(zhǎng)而不分硫支共價(jià)結(jié)合重復(fù)二糖長(zhǎng)鏈的糖蛋白，在細(xì)胞中和細(xì)胞外基質(zhì)中含量豐富，并在發(fā)育和病理生理學(xué)中發(fā)揮多種作用[48]。PGs與腫瘤發(fā)生過程相關(guān)，主要影響腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、遷移和侵襲能力，同時(shí)對(duì)腫瘤血管生成具有促進(jìn)或抑制作用[49]。研究表明，在胰腺癌的發(fā)生中，硫酸軟骨素蛋白多糖4（chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4）和磷脂酰肌醇蛋白多糖-1（glypican-1，GPC-1）起著重要作用[50-52]。差異下調(diào)基因主要富集在MAPK信號(hào)通路，該通路是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[53]。鼠類肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene，）突變激活MAPK通路，是胰腺癌起始和進(jìn)展的關(guān)鍵遺傳驅(qū)動(dòng)因素[54-55]，通路上的鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體（V-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog，RAF）、絲裂原活化的蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino terminal kinase，JNK）等信號(hào)的激活對(duì)于胰腺癌的發(fā)生具有促進(jìn)作用[56-58]。

六邊形-各中藥獨(dú)有成分 正方形-2種及以上中藥的共同成分 菱形-靶點(diǎn)，圖7同

圖7 預(yù)測(cè)中藥干預(yù)胰腺癌“炎-癌”進(jìn)展的關(guān)鍵靶點(diǎn)

為了進(jìn)一步研究DEGs與胰腺癌之間的關(guān)系，通過PPI分析篩選出20個(gè)關(guān)鍵基因，對(duì)上述關(guān)鍵基因與胰腺癌的OS和DFS的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)、、、、高表達(dá)為OS的危險(xiǎn)因素，高表達(dá)為OS的保護(hù)因素；、、、高表達(dá)為DFS的危險(xiǎn)因素，這與其他研究結(jié)果基本一致，互相映證，從側(cè)面體現(xiàn)了本研究具有較高的可信度[59-64]。其中可能是胰腺癌的保護(hù)因素，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證，可以確定的是，是一種神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，在細(xì)胞黏附和發(fā)育過程中具有調(diào)節(jié)作用。近期的一項(xiàng)研究表明成釉細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)的可抑制細(xì)胞遷移，從而起到抗成釉細(xì)胞瘤作用[65]。的過度表達(dá)通過抑制長(zhǎng)鏈非編碼RNA1060（long intergenic non-protein coding RNA 1060，Linc01060）的表達(dá)來促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，同時(shí)可通過上調(diào)ERK的表達(dá)來加速胰腺癌細(xì)胞增殖[66]。表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程，從而提高胰腺癌細(xì)胞遷移率[67]。SUMO信號(hào)通路與原癌基因相連通，可以導(dǎo)致低分化程度胰腺癌的發(fā)生，但其具體機(jī)制仍不明確[68]。和是細(xì)胞表面基質(zhì)受體，與細(xì)胞外基質(zhì)一同介導(dǎo)致癌信號(hào)傳導(dǎo)，其表達(dá)增高可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[69-70]。的高表達(dá)可上調(diào)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）的表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[71]。眾多基因顯著影響胰腺癌的預(yù)后，進(jìn)一步說明胰腺癌的致病分子具有復(fù)雜性和多樣性，未來的研究任重而道遠(yuǎn)。

中醫(yī)藥作為我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，經(jīng)歷了數(shù)千年的實(shí)踐檢驗(yàn)，對(duì)于胰腺癌的治療具有一定的特色。鑒于此，將上述顯著影響胰腺癌預(yù)后的基因輸入Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)，按照臨床常用原則篩選出夏枯草、金錢草、赤芍、生地、紫蘇、菟絲子6味中藥。為了進(jìn)一步探索這6味中藥治療胰腺癌的機(jī)制，進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些中藥主要通過調(diào)控、、、等基因發(fā)揮作用。胰腺癌的發(fā)生與中焦脾胃關(guān)系密切，其證候特征是本虛標(biāo)實(shí)，本虛為臟腑元?dú)馓撊?，以脾虛為主；?biāo)實(shí)為肝郁、濕熱、痰瘀[72]。臨床治療以疏肝健脾、活血化瘀、清熱燥濕為主。夏枯草、金錢草、赤芍、紫蘇、生地和菟絲子均屬于上述治則范疇，現(xiàn)代藥理研究表明，這些藥物的有效成分具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化的作用[73-77]。宋瑋等[78]發(fā)現(xiàn)夏枯草注射液可以通過調(diào)控胰腺癌的Bcl-2家族基因表達(dá)，使人胰腺癌PANC-1細(xì)胞Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。Matos等[79]發(fā)現(xiàn)紫蘇的有效成分紫蘇醇能促進(jìn)胰腺癌患者腫瘤細(xì)胞凋亡。黃巍等[80]發(fā)現(xiàn)赤芍的有效成分芍藥苷可通過激活Caspase途徑抑制Panc-1細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，從而達(dá)到抗胰腺癌效果。葉春林等[77]發(fā)現(xiàn)菟絲子多糖能抑制PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)，且呈濃度相關(guān)性。進(jìn)一步說明了本研究的藥物預(yù)測(cè)結(jié)果符合中醫(yī)對(duì)胰腺癌的認(rèn)識(shí)，符合臨床實(shí)際，具有較高的可信度。然而其具體機(jī)制仍不明確，有待深入挖掘，而本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)出來中藥通過調(diào)節(jié)PTGS1、PTGS2、NCOA2、PGR等靶點(diǎn)從而達(dá)到防治胰腺癌的作用，不失為一個(gè)有意義的研究方向。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)胰腺癌及PC基因芯片的數(shù)據(jù)挖掘及生物信息學(xué)分析，篩選出胰腺癌“炎-癌”轉(zhuǎn)化的20個(gè)關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)病毒生命周期、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、染色質(zhì)的共價(jià)修飾、癌癥蛋白多糖和MAPK等生物過程和信號(hào)通路等在胰腺癌癌變中起著關(guān)鍵作用。夏枯草、金錢草、生地、赤芍、紫蘇、菟絲子及其活性成分可能通過多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)抗胰腺癌作用。為后續(xù)胰腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其潛在治療藥物的研究提供了新的研究方向?；蛐酒夹g(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為中醫(yī)藥的發(fā)展帶來了新的契機(jī)，通過生物信息學(xué)技術(shù)挖掘疾病潛在靶點(diǎn)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提取中藥作用靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供了新的思路和方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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XIAO Xiang, WU Xuan-yu

Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, China

To screen the differentially expressed genes (DEGs) between pancreatic cancer (PC) and chronic pancreatitis (CP) tissues through bioinformatics techniques, in order to predict the traditional Chinese medicine (TCM) that can interfere with the “inflammation-cancer” transformation process and their the potential therapeutic targets and mechanisms.GSE151945 and GSE30134 gene chips were obtained from Gene Expression Omnibus (GEO), and R software was applied to normalize the data, screen DEGs, and perform gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) enrichment analysis. The protein-protein interaction network was constructed by STRING database, the protein-protein interaction network map was created by Cytoscape, and the hub genes were screened by CytoHubba plug-in. R software was used to analyze the effect of the hub gene on the survival analysis of pancreatic cancer and screen for genes that significantly affect the prognosis of pancreatic cancer, visualized by Kaplan-Meier curves. The above genes were mapped with Coremine Medical database to predict potential therapeutic TCM. The chemical components of the TCM were obtained from TCMSP and TCMID databases. The network diagram of “TCM-component-target” was constructed by Cytoscape, and the key targets were screened by CytoHubba plug-in.A total of 178 DEGs were screened, including 88 up-regulated and 90 down-regulated genes. DEGs were mainly involved in biological functions such as virus life cycle, extracellular structure, extracellular matrix organization, and covalent modification of chromatin. KEGG pathway analysis showed that DEGs were mainly enriched in human papillomavirus infection, shigellosis, Huntington’s disease, cancer proteoglycan, and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway. A total of 20 hub genes were obtained, and survival analysis showed that adhesion-linkage-associated protein nucleoprotein vinculin (), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L (L), small ubiquitin like modifier 3 (), integrin subunit alpha 3 (), integrin subunit beta 5 (), syndecan 1(), and neural cell adhesion molecule 1 () significantly affected the prognosis of PC. The potential TCMs that can interfere with the “inflammation-cancer” transformation process of PC include Xiakucao (),Jinqiancao (),Zisu (),Shengdi (),Chishao (),Tusizi ().The transformation mechanism of “inflammation-cancer” of PC is complex, and TCM can interfere with the “inflammation-cancer” transformation process of PC through multiple targets. This study will provide a reference direction for the study of the pathogenesis and therapeutic agents of PC.

chronic pancreatitis; pancreatic cancer; bioinformatics; prediction of traditional Chinese medicine;;;(L.) Britt.;;;

R285

A

0253 - 2670(2022)15 - 4795 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.023

2022-02-18

成都中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生科研實(shí)踐創(chuàng)新課題（ky-2021049，ky-2022004）

肖 祥，男，本科在讀，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)學(xué)。E-mail: xxiangtcm@163.com

通信作者：吳宣諭，女，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)學(xué)。E-mail: w_syuanyu@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]