莫鈞茹，覃 淼#，朱素梅，黃金梅，奉建芳, 2，黎 芳, 3*，梁健欽, 2, 3*

基于藥效團模型的龍血竭潛在降糖活性成分篩選

莫鈞茹1，覃 淼1#，朱素梅1，黃金梅1，奉建芳1, 2，黎 芳1, 3*，梁健欽1, 2, 3*

1. 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200 2. 廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術研究中心，廣西 南寧 530023 3. 廣西中藥制劑共性技術研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧 530200

基于藥效團模型篩選龍血竭潛在降糖活性成分。采用葡萄糖氧化酶法測定龍血竭含藥血清對HepG2細胞胰島素抵抗模型的葡萄糖消耗量。通過液相色譜-質譜聯(lián)用技術（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）鑒定和檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、Web of Science數(shù)據(jù)庫建立龍血竭的化合物庫，通過Discovery Studio的吸收、分布、代謝、排泄、毒性（absorption，distribution，metabolism，excretion，toxicity，ADMET）模塊預過濾化合物，通過鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2）、二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）藥效團模型和分子對接篩選候選有效成分，通過細胞實驗驗證候選有效成分的降糖活性。與模型組比較，龍血竭含藥血清能使胰島素抵抗的HepG2細胞葡萄糖消耗量顯著增加（＜0.05）。經(jīng)ADMET模塊篩選到179個化合物，經(jīng)最優(yōu)藥效團模型SGLT2-02、DPP4-03從中篩選出SGLT2、DPP4潛在抑制劑14個，其中5'-甲氧基松脂素（medioresinol）、開環(huán)異落葉松樹脂酚[(+)-secoisolariciresinol]、1-palmitoylglycerophosphocholine、-茶氨酸（-theanine）的結合能均優(yōu)于對照配體，分別為?852.285、?798.060、?916.116、?667.356 kJ/mol。與模型組相比，開環(huán)異落葉松樹脂酚、-茶氨酸能顯著提高HepG2細胞葡萄糖消耗量（＜0.05、0.01）。體外實驗證實龍血竭顯示良好的降糖活性，龍血竭中的5'-甲氧基松脂素、開環(huán)異落葉松樹脂酚是SGLT2的潛在抑制劑，1-palmitoylglycerophosphocholine、-茶氨酸是DPP4的潛在抑制劑，開環(huán)異落葉松樹脂酚、-茶氨酸具有降糖活性。

龍血竭；降糖；ADMET；藥效團；分子對接；鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2；二肽基肽酶4；開環(huán)異落葉松樹脂酚；-茶氨酸

龍血竭（Chinese dragon’s blood）是從百合科劍葉龍血樹(Lour.) S. C. Chen的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂，具有活血散瘀、定痛止血、斂瘡生肌的功效[1]。研究表明，龍血竭提取物能夠降低四氧嘧啶[2]、鏈尿佐菌素[3]誘導的糖尿病小鼠血糖水平，但是，龍血竭的降糖活性成分及作用機制尚未清楚。本研究通過體外的胰島素抵抗細胞模型評價龍血竭含藥血清對HepG2細胞胰島素抵抗的作用，通過液相色譜-質譜聯(lián)用技術（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）檢測，結合文獻篩選龍血竭化學成分，通過吸收、分布、代謝、排泄、毒性（absorption，distribution，metabolism，excretion，toxicity，ADMET）性質對化合物進行初篩，基于分子共同特征的藥效團模型和分子對接篩選鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2）、二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）的潛在抑制劑，最后通過體外實驗驗證潛在降糖活性成分的降糖作用。本研究為從龍血竭中篩選SGLT2、DPP4抑制劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株

人肝癌HepG2細胞株（SCSP-5036），中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 動物

昆明種小鼠，雄性，SPF級，體質量18～22 g，購于北京斯貝福生物技術有限公司（SCXK京2019-001）。動物實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理委員會批準（批準號DW20210628-072）。

1.3 試劑與藥物

龍血竭（批號20170101）購自廣西中醫(yī)藥大學制藥廠；二甲雙胍（批號419K026）、胰島素（批號830M021）、PBS緩沖液（批號20210920）、MTT試劑（批號1123A0517）均購自Solarbio公司；開環(huán)異落葉松樹脂酚[(+)-secoisolariciresinol，批號PHL80532，質量分數(shù)≥95%]、-茶氨酸（-theanine，批號SMB00395，質量分數(shù)≥98%）均購自Sigma-Aldrich公司；高糖培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清均購自Biological Industries公司；葡萄糖試劑盒（批號20211012）購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

Thermo Vanquish超高效液相系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（Waters公司，美國）；Thermo Q Exactive Focus 質譜檢測器（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱（Panasonic公司）；Infinite 200 PRO酶標儀（TECAN Austria GmbH公司）。

1.5 軟件與數(shù)據(jù)庫

PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）；PubMed數(shù)據(jù)庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/）；Drugbank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）；PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）；Discovery Studio（2016）軟件。

2 方法

2.1 細胞實驗[4]

2.1.1 龍血竭含藥血清的制備 8只小鼠ig給予龍血竭混懸液（取5.67 g龍血竭加入適量水、0.1%羧甲基纖維素鈉，均質，加水調至質量濃度為0.27 g/mL混懸液）4.438 8 g/(kg·d)，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后摘除眼球取血，3000 r/min離心10 min，即得龍血竭含藥血清。

2.1.2 不同濃度胰島素對細胞活性的影響 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，以2×105個/mL的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL，分別用1.00、0.10、0.01 μmol/L濃度胰島素處理，以正常培養(yǎng)液處理作為對照，每組5個復孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，每孔加入20 μL 0.5% MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h后加入150 μL DMSO，于490 nm下測定吸光度（），計算細胞存活率。

細胞存活率=給藥/對照

2.1.3 胰島素作用濃度篩選 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，以2×105個/mL的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL。分別用1.00、0.10、0.01 μmol/L濃度胰島素處理，以正常培養(yǎng)液處理作為對照，每組5個復孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，棄去原培養(yǎng)液，換上不完全培養(yǎng)基饑餓處理24 h，按葡萄糖檢測試劑盒法測定各組葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。

2.1.4 胰島素作用時間篩選 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，以2×105個/mL的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL。用篩選出的最佳濃度胰島素處理，以正常培養(yǎng)液處理作為對照，每組5個復孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、36、48 h，棄去原培養(yǎng)液，換上不完全培養(yǎng)基饑餓處理24 h，按葡萄糖檢測試劑盒法測定各組葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。

2.1.5 龍血竭含藥血清對HepG2細胞胰島素抵抗的作用 以二甲雙胍作為陽性對照，判斷龍血竭含藥血清對胰島素抵抗是否有作用。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，以2×105個/mL的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL。隨機分為對照組（正常培養(yǎng)液處理）、模型（最佳濃度胰島素）組、二甲雙胍陽性（1 mmol/L）組及龍血竭含藥血清低、高劑量（2.5%、5.0%含藥血清，劑量經(jīng)預試驗確定）組。每組5個復孔。除對照組外，其他組建立胰島素抵抗模型，給藥24 h，棄去原培養(yǎng)液，換上不完全培養(yǎng)基饑餓處理24 h，按葡萄糖檢測試劑盒說明書測定各組葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。

2.2 化合物庫的建立

2.2.1 基于LC-MS的成分檢測

（1）龍血竭溶液的制備：精密稱量100 mg龍血竭粉末樣品于2 mL離心管中，加入600 μL甲醇（含2-氯--苯丙氨酸），渦旋振蕩30 s，加入100 mg玻璃珠，放入組織研磨器中，55 Hz研磨90 s，室溫超聲10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm膜濾過，取濾液即得。

（2）色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；體積流量0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL；正離子模式流動相為0.1%甲酸乙腈（C）-0.1%甲酸水（D），梯度洗脫程序：0～1 min，2% C；1～9 min，2%～50% C；9～12 min，50%～98% C；12～13.5 min，98% C；13.5～14 min，98%～2% C；14～20 min，2% C；負離子模式流動相為乙腈（A）-5 mmol/L甲酸銨水（B），梯度洗脫程序：0～1 min，2% A；1～9 min，2%～50% A；9～12 min，50%～98% A；12～13.5 min，98% A；13.5～14 min，98%～2% A；14～17 min，2% A。

（3）質譜條件：電噴霧離子源，正離子噴霧電壓3.50 kV，負離子噴霧電壓?2.50 kV，鞘氣流速30 arb，輔助氣體流速10 arb，毛細管溫度325 ℃，一級全掃描（81～1000）分辨率70 000，碰撞能量30 eV，二級分辨率17 500。

2.2.2 基于文獻的成分篩選 于中國知網(wǎng)（CNKI）、Web of Science數(shù)據(jù)庫中以“龍血竭”并“化學成分”進行主題檢索，通過閱讀摘要，選擇經(jīng)核磁共振色譜法鑒定的龍血竭成分，合并數(shù)據(jù)庫檢索與本研究LC/MS分析所得成分。

2.2.3 化合物的ADMET篩選 從PubChem數(shù)據(jù)庫獲得化合物2D結構，保存為SDF格式，導入Discovery Studio，使用ADMET Descriptors功能，得到人體腸道吸收性（human intestinal absorption，HIA）、血腦屏障通透性（blood brain barrier，BBB）等結果，篩選位于HIA及BBB 99%置信區(qū)間內的化合物建庫。

2.2.4 龍血竭化合物庫的建立 經(jīng)ADMET初篩的化合物，通過“Prepare Ligands”及“Minimize Ligands”進行加氫、結構優(yōu)化，利用“Build 3D Database”功能構建龍血竭化合物數(shù)據(jù)庫，參數(shù)number of conformations設置為200，conformation method選擇BEST。

2.3 藥效團篩選

2.3.1 基于配體的藥效團模型的構建 通過DrugBank數(shù)據(jù)庫“targets”項輸入靶點名稱SGLT2及DPP4，選取已經(jīng)得到認可、藥理作用明確的抑制劑作為訓練集分子（SGLT2抑制劑5個、DPP4抑制劑4個），從PubChem數(shù)據(jù)庫獲得分子的SDF格式文件，導入Discovery Studio，利用“Pharmacophore”模塊的“Edit and Cluster Features”識別所有特征元素，并通過該模塊下“Common Feature Pharmacophore Generation”構建基于分子共同特征的藥效團模型。參數(shù)conformation generation選擇BEST，maximum conformation設置為200，energy threshold設置為10，其他設為默認值。

2.3.2 藥效團模型的驗證 通過測試集分子（測試集包括活性分子、非活性分子）對藥效團模型可靠性進行評價。SGLT2的測試集分子由18個活性分子、18個非活性分子構成，DPP4的測試集分子由16個活性分子、17個非活性分子構成。通過Discovery Studio中“Pharmacophore”下的“Ligand Profiler”模塊對所有模型進行驗證。Conformation generation選擇BEST，maximum conformation設置為200，energy threshold設置為10。

2.3.3 潛在活性分子的虛擬篩選 利用“Search，Screen and Profile”模塊篩選潛在活性分子，“Search 3D Database”參數(shù)列表“Database”選擇龍血竭化合物庫，“Pharmacophore”選擇最優(yōu)藥效團模型，搜索與藥效團相匹配的化學成分。

2.4 分子對接

2.4.1 受體與配體分子的準備 運用“Prepare Ligands”和“Minimize Ligands”模塊優(yōu)化與藥效團匹配的化合物，作為配體分子。通過PDB數(shù)據(jù)庫檢索，獲得SGLT2與DPP4蛋白的PDB格式文件，“Clean Protein”和“Prepare Protein”模塊去除蛋白多構象，“Add Polar”為蛋白加氫，以蛋白質共晶化合物所在空間為活性中心，將蛋白質分子定義為受體分子。

2.4.2 分子對接 通過LibDock分子對接模式將受體與配體分子進行快速精準的對接，參數(shù)number of hotspots設置為100，docking tolerance設置為0.25，conformation method選擇BEST，minimization algorithm選擇smart minimizer。根據(jù)LibDock score篩選化合物排名前3的構型，通過“Calculate Binding Energies”計算結合能，將蛋白質共晶化合物作為對照配體，篩選潛在抑制劑。

2.5 潛在抑制劑的降糖活性實驗驗證

按照“2.1.5”項方法測定潛在抑制劑的降糖活性，其中實驗組龍血竭含藥血清替換為潛在抑制劑，劑量為50、100 μmol/L。

3 結果

3.1 龍血竭對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗的影響

由圖1-A可知，胰島素濃度為1.00 μmol/L時，HepG2細胞存活率顯著下降（＜0.01），顯示該濃度下細胞的生長被抑制；與此相反，濃度為0.10、0.01 μmol/L時胰島素對細胞生長無顯著抑制。由圖1-B可知，在胰島素濃度為1.00、0.10、0.01 μmol/L時，濃度越小，葡萄糖消耗量越少，與對照組相比，胰島素濃度為0.01 μmol/L時，細胞葡萄糖消耗量顯著下降（＜0.05），提示該濃度下細胞處于胰島素抵抗狀態(tài)。由圖1-C可知，時間越長，葡萄糖消耗量越大，與對照組相比，36 h的細胞葡萄糖消耗量顯著下降（＜0.05），提示胰島素處理36 h為細胞的最佳造模時間。胰島素抵抗模型最佳條件：0.01 μmol/L胰島素處理36 h。如圖1-D所示，與對照組相比，模型組的葡萄糖消耗量顯著降低（＜0.01），提示胰島素抵抗模型成功建立，與模型組相比，二甲雙胍、龍血竭含藥血清組葡萄糖消耗量顯著增加（＜0.05、0.01），說明二甲雙胍與龍血竭均能促進HepG2細胞對葡萄糖的攝入，具有改善胰島素抵抗的作用，龍血竭含藥血清高劑量組作用更明顯。

3.2 龍血竭化合物庫

3.2.1 成分分析 通過LC-MS技術分析，共得到176個龍血竭化學成分，總離子流色譜圖如圖2所示，3個平行龍血竭樣品的色譜峰響應強度與保留時間基本重合，表明儀器誤差較??；通過文獻檢索得到經(jīng)核磁驗證的龍血竭化學成分257個，與LC-MS分析得到的176個成分合并、去重，刪除無CAS號的成分，最終得到龍血竭化學成分209個[5-16]。

3.2.2 化合物ADMET預過濾 SGLTs是人體中重要的葡萄糖轉運蛋白，SGLT2能促進葡萄糖轉運體對葡萄糖的吸收，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可檢測到該類蛋白的表達[17]。如圖3所示，從209個龍血竭化學成分中，篩去30個化學成分（它們位于BBB及HIA的99%置信區(qū)間外），剩余179個化合物被認為BBB和HIA較好。

3.3 藥效團篩選

3.3.1 藥效團模型的構建 如表1所示，通過識別SGLT2、DPP4的訓練集分子的共同特征元素，分別建立2個靶點的10個藥效團模型，其中R表示芳環(huán)中心，P表示正點離子中心，H表示疏水特征，A表示氫鍵受體特征，D表示氫鍵供體特征，Rank值表示該藥效團模型的打分情況。在SGLT2的10個藥效團中，編號01、02、03模型Rank值最高（61.355分），SGLT2潛在抑制劑的結構應具備1個芳環(huán)中心、1個疏水基團以及2個氫鍵受體的特征；DPP4藥效團中01模型Rank值最高（77.401分），預測DPP4的潛在抑制劑應同時具備1個正離子中心、1個疏水基團以及2個氫鍵受體的特征。

A-細胞活性實驗 B-胰島素濃度篩選 C-胰島素作用時間篩選 D-龍血竭含藥血清對胰島素抵抗作用 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

A-正離子模式 B-負離子模式

3.3.2 藥效團模型的驗證 如圖4所示，匹配熱圖中不同顏色代表Fitvalue大小，顏色越趨近于紅色，值越大，說明該分子對藥效團的匹配度越高。由圖4-A可知，近一半的活性分子可與SGLT2的10個藥效團匹配，且匹配度達到2.500以上，顯示10個藥效團均具備良好的區(qū)分能力，其中以SGLT2-02藥效團模型最優(yōu)。由圖4-B可知，絕大多數(shù)活性分子與藥效團匹配度在2.250以上，DPP4-03藥效團模型可匹配最多數(shù)量的活性分子，且多為Fit value高的橙色區(qū)域，對非活性分子多為Fit value低的藍色區(qū)域。SGLT2-02藥效團模型、DPP4-03藥效團模型見圖5。

圖3 龍血竭化學成分BBB與HIA的95%、99%置信區(qū)間篩選

3.3.3 潛在活性分子的虛擬篩選 在179個化學成分中，化合物丁香樹脂酚（syringaresinol，L1，2.572 29）、松脂酚（pinoresinol，L2，2.478 66）、5′-甲氧基松脂素（medioresinol，L3，2.457 06）、表松脂酚（epipinoresinol，L4，2.381 18）、開環(huán)異落葉松樹脂酚（L5，2.144 68）、3,2′,4′-三羥基-4-甲氧基查耳酮（3,2′,4′-trihydroxy-4-methoxychalcone，L6，0.475 80）與SGLT2-02藥效團相匹配；-茶氨酸（L7，/173.093 1，3.362 70）、1-palmitoylglycerophosphocholine（L8，/496.344 8，3.350 16）、practolol（L9，/265.148 5，2.952 77）、metanephrine（L10，/180.101 3，2.680 57）、epinephrine（L11，/166.084 9，2.365 02）、thymidine（L12，/242.176 4，2.333 85）、nalbuphine（L13，/358.208 7，1.904 56）、mepyramine（L14，/286.187 4，1.225 61）能夠與DPP4-03藥效團模型匹配，F(xiàn)it value及部分潛在活性分子質荷比見括號內數(shù)值。

表1 藥效團構建結果

A-SGLT2的匹配熱圖 B-DPP4的匹配熱圖

圖5 SGLT2最優(yōu)藥效團模型(SGLT2-02) 與DPP4最優(yōu)藥效團模型(DPP4-03)

3.4 潛在抑制劑篩選

將SGLT2、DPP4受體與潛在活性分子進行對接，其中7R3、D3C分別為受體的共晶化合物。如表2所示，5′-甲氧基松脂素（L3）、開環(huán)異落葉松樹脂酚（L5）與SGLT2的結合能小于對照配體7R3，分別為?852.285、?798.060 kJ/mol，主要與氨基酸殘基VAL157、ASP158、HIS80發(fā)生碳氫鍵、離子交換、疏水相互作用等（圖6-A、B）；1-palmitoyl- glycerophosphocholine（L8）、-茶氨酸（L7）與DPP4的結合能分別為?916.116、?667.356 kJ/mol，低于對照配體D3C，兩分子主要與氨基酸殘基TYR547形成氫鍵、與ARG125形成吸電荷相互作用、與SER630形成氫鍵相互作用（圖6-C、D）。提示TYR547、ARG125與SER630是DPP4與抑制劑相互作用的關鍵氨基酸殘基。

表2 潛在活性分子與靶點的對接結合能

A-L3與SGLT2的相互作用圖 B-L5與SGLT2的相互作用圖 C-L8與DPP4的相互作用圖 D-L7與DPP4的相互作用圖

3.5 潛在抑制劑L5、L7的降糖活性驗證

采用細胞實驗對潛在抑制劑進行降糖活性驗證，因中國食品藥品檢定研究院、Sigma-Aldrich公司不提供5′-甲氧基松脂素、1-palmitoylglycero-phosphocholine，無法購買，故只對開環(huán)異落葉松樹脂酚、-茶氨酸進行驗證，結果如圖7所示，與模型組相比，二甲雙胍組、開環(huán)異落葉松樹脂酚（L5）、-茶氨酸（L7）組葡萄糖消耗量顯著增加（＜0.05、0.01），其中，L5、L7的100 mmol/L劑量組葡萄糖消耗量與二甲雙胍組相似，提示L5、L7均具有改善胰島素抵抗的作用，且高劑量組促葡萄糖吸收能力更強。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

4 討論

靶向葡萄糖代謝途徑的降糖藥物篩選，一直是降糖藥物研發(fā)領域的熱點。目前糖尿病藥物除了有傳統(tǒng)的胰島素、雙胍類、α-糖苷酶抑制劑、磺脲類及格列奈類藥物以及過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）激動劑以外，還有近年來上市的DPP-4抑制劑、胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）類似物和SGLT-2抑制劑等藥物。胃腸道中SGLTs的主要功能是將葡萄糖轉運至循環(huán)血液系統(tǒng)中。在高糖患者體內，若能抑制SGLTs活性，則可達到降低血糖的目的，SGLT2抑制劑能夠通過緩解糖毒性造成的氧化應激，增強胰島素信號通路的傳導，改善胰島素抵抗[18]。腸道中的GLP-1可作用于受體促進胰島素合成分泌，但其極易被DPP4快速降解失去活性，且DPP4在肝臟中的過度表達降低了胰島素敏感性，從而導致胰島素抵抗[19]。因此，有必要開發(fā)研究出更多的SGLT-2、DPP4抑制劑改善胰島素抵抗，降低血糖。龍血竭中酚類化合物可抑制SGLT2活性，通過增加尿糖降低血糖[20]，但未見龍血竭抑制DPP4靶點的相關報道。本研究通過體外實驗已驗證龍血竭可顯著增加胰島素抵抗模型的HepG2細胞葡萄糖消耗量，龍血竭中降糖活性化合物和靶點尚未清楚。

計算機輔助藥物設計技術（computer aided drug design，CADD）通過計算機使用數(shù)學模型進行計算、模擬，預測藥物分子與靶點間的相互作用，從大量預選化合物中篩選出有潛力的先導化合物，大大提高了藥物開發(fā)的速度。藥效團作為尋找先導化合物的重要手段，應用于虛擬篩選數(shù)據(jù)庫、判斷分子的某類藥效特征、輔助改造分子結構、推斷受體與配體間可能的作用模式等[21]?；谒幮F的活性靶點和作用成分篩選是近年研究熱點，已經(jīng)應用在降糖靶點PPAR、G蛋白偶聯(lián)受體40（G-protein-coupled receptor 40，GPR40）激動劑的高通量篩選上。本研究建立基于SGLT2、DPP-4抑制劑分子共同特征的藥效團，從龍血竭化合物庫篩選得到潛在活性分子，再與靶點進行分子對接篩選得到4個潛在的SGLT2、DPP-4抑制劑，分別為5′-甲氧基松脂素、開環(huán)異落葉松樹脂酚、1-palmitoylglycerophos-phocholine和-茶氨酸。其中，5′-甲氧基松脂素、開環(huán)異落葉松樹脂酚均為木脂素類化合物，5′-甲氧基松脂素主要存在于杜仲，具有抗腫瘤、降壓等作用；開環(huán)異落葉松樹脂酚具有降糖、抗氧化、預防乳腺癌及前列腺癌等作用，開環(huán)異落葉松樹脂酚通過清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picylhydrazyl，DPPH）自由基使由鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的空腹血糖降低33.4%[22]；1-palmitoylglycerophosphocholine主要在肝磷脂分解代謝中發(fā)揮作用；-茶氨酸為酰胺類化合物，最早于綠茶葉中發(fā)現(xiàn)，具有降糖、抗腫瘤、神經(jīng)保護等作用，可通過促進糖原合成、抑制糖異生及促進糖酵解，從而降低葡萄糖含量[23]。以上提示，4個化合物顯示降糖潛力，龍血竭降糖活性可能與4個化合物的活性相關，它們是SGLT2、DPP-4的潛在抑制劑。

5 結論

本研究通過細胞實驗證實了龍血竭具有改善HepG2細胞胰島素抵抗的作用，利用LC-MS技術與文獻檢索建立了龍血竭的成分庫，通過構建基于共同特征的藥效團虛擬篩選出6個SGLT2的潛在抑制活性分子、8個DPP4的潛在抑制活性分子，再將活性分子與靶點進行分子對接，篩選得到5′-甲氧基松脂素、開環(huán)異落葉松樹脂酚、1-palmitoylglycerophosphocholine與-茶氨酸是SGLT2、DPP-4的潛在抑制劑，最后通過細胞實驗證實開環(huán)異落葉松樹脂酚、-茶氨酸具有降糖活性，為揭示龍血竭降糖作用和機制提供依據(jù)。

志謝:廣西大學于凱博士為分子對接和藥效團分析提供幫助。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening of potential hypoglycemic active ingredients fromon pharmacophore model

MO Jun-ru1, QIN Miao1, ZHU Su-mei1, HUANG Jin-mei1, FENG Jian-fang1, 2, LI Fang1, 3, LIANG Jian-qin1, 2, 3

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Superior Proprietary Chinese Medicine and Ethnic Medicine Development Engineering Technology Research Center, Nanning 530023, China 3. Guangxi Key Laboratory of Common Technology of Traditional Chinese Medicine Preparation in Laboratory, Nanning 530200, China

To screen potential hypoglycemic active ingredients of Longxuejie (, Chinese dragon’s blood) based on pharmacophore model.The glucose consumption of serum containingon insulin resistance model of HepG2 cells was determined by glucose oxidase method. The compound database ofwas established by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) identify and searching CNKI and Web of Science database. Then compounds were filtered by ADMET (absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity) module of Discovery Studio. The candidate active ingredients were screened by pharmacophore models for sodium-glucose cotransporter 2 (SGLT2) and dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) and molecular docking. Finally, the activity of candidate active ingredients were verified by cellular experiments.The serum containingsignificantly increased glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells compared with the model group (< 0.05). A total of 179 compounds fromwere screened by ADMET module. A total of 14 potential inhibitors of SGLT2 and DPP4 were screened by the optimal pharmacophore model of SGLT2-02 and DPP4-03. The binding energies of medioresinol, (+)-secoisolariciresinol, 1-palmitoylglycerophosphocholine and-theanine were lower than the control ligands, which were ?852.285, ?798.060, ?916.116, ?667.356 kJ/mol, respectively. (+)-Secoisolariciresinol and-theanine could significant increase glucose consumption of HepG2 cells compared with the model group (< 0.05, 0.01).showed goodhypoglycemic activity. Medioresinol and (+)-secoisolariciresinol were the potential inhibitors of SGLT2, and 1-palmitoylglycerophosphocholine and-theanine were the potential inhibitors of DPP4. (+)-Secoisolariciresino and-theanine showed goodhypoglycemic activity.

; hypoglycemic effect; ADMET; pharmacophore; molecular docking; sodium-glucose cotransporter 2 (SGLT2); dipeptidyl peptidase 4 (DPP4); (+)-secoisolariciresino;-theanine

R284；R285

A

0253 - 2670(2022)15 - 4764 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.020

2022-05-11

國家自然科學基金項目（81960872）；廣西研究生教育計劃項目（YCSW2021240）

莫鈞茹（1997—），女，2020級在讀碩士生，從事中藥新藥研究與開發(fā)。Tel: 15578681531 E-mail: 2423413578@qq.com

通信作者：黎 芳，講師，從事中藥新藥研究與開發(fā)。Tel: 18978362162 E-mail: 273228824@qq.com

梁健欽，研究員，從事中藥新藥研究與開發(fā)。Tel: 15977775577 E-mail: 80004622@qq.com

#共同第一作者：覃 淼（1998—），女，2020級在讀碩士生，從事中藥新藥研究與開發(fā)。Tel: 15676117696 E-mail: 1670698188@qq.com

[責任編輯 潘明佳]