魏 晴，鄭 雙，何蘭鳳，梁珊珊，孫慶文

（貴州中醫(yī)藥大學a.藥學院；b.大果木姜子研究中心；c.植物多糖研究中心，貴州 貴陽 550025）

米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）為樟科樟屬植物，多生長于我國西南地區(qū)，以貴州為主。其干燥成熟果實為大果木姜子，是貴州十大苗藥之一。大果木姜子具有溫中散寒，理氣止痛的作用。通常人們把它當作治療胸腹疼痛等疾病的藥物[1]。近些年來對大果木姜子的化學成分和藥理學方面研究比較深入[2-4]。此外，研究發(fā)現(xiàn)米槁除了果實可以作為藥用部位，米槁葉片、種子也可作為其藥用部位。但對于葉片和種子這兩個新藥用部位的研究幾乎是一片空白，前期研究發(fā)現(xiàn)米槁葉片有很好的抗氧化作用，進一步發(fā)現(xiàn)醇提物效果更好，因此，推測米槁葉片發(fā)揮抗氧化的成分可能為黃酮組分。黃酮是有效的抗氧化劑，可保護植物免受不利環(huán)境條件的影響，因此，現(xiàn)在被用于大量流行病學和實驗研究，以評估它們在多種急性和慢性人類疾病中可能產(chǎn)生的有益作用[5,6]。此外，體外和體內(nèi)研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和強大的抗癌活性[7-11]。為進一步使米槁葉片發(fā)揮更好的抗氧化作用，本課題以米槁葉片中黃酮為研究對象，以提取時間、液料比、超聲功率、乙醇濃度、提取溫度為考察因素，以黃酮含量為指標性成分評價米槁葉片黃酮的最佳提取工藝。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

米槁葉片采摘自貴州省羅甸縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為樟科樟屬植物米槁Cinnamomum migao H.W.Li的葉片。

蘆丁標準品（純度＞98%北京萬佳標準物質(zhì)研發(fā)中心）；乙醇（純度＞98%南京化學試劑股份有限公司）；DPPH（純度＞98%美國Sigma-Aldrich公司），其它化學試劑均為分析純。

UV7型紫外可見分光光度計（梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司）；HH-600型恒溫水浴（上海一科儀器有限公司）；FB224型電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的前處理 將新鮮的米槁葉片置于陰涼處晾干，除去枝梗和雜質(zhì)，粉碎，然后過40目篩，即得米槁葉片粉末。

1.2.2 超聲提取單因素試驗 影響黃酮含量的因素主要包括提取時間、超聲溫度、功率、液料比、乙醇濃度等。因此，分別對以上單因素進行考察，篩選出對黃酮含量影響最大的因素。

1.2.2.1 提取時間對黃酮含量的影響 分別稱取米槁葉片粉末5g，按照液料比20∶1（mL∶g），超聲功率為80W，乙醇濃度為70%，超聲溫度為60℃，提取時間分別為25、30、35、40、45min進行提取，考察不同提取時間對黃酮含量的影響。

1.2.2.2 超聲功率對黃酮含量的影響 分別稱取米槁葉片粉末5g，按照液料比20∶1（mL∶g），提取時間30min，乙醇濃度為70%，超聲溫度為60℃，超聲功率分別為20、40、60、80、100W，考察不同超聲功率對黃酮含量的影響。

1.2.2.3 液料比對黃酮含量的影響 分別稱取米槁葉片粉末5g，按照提取時間30min，超聲功率80W，乙醇濃度為70%，超聲溫度為60℃，液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL∶g），考察不同液料比對黃酮含量的影響。

1.2.2.4 乙醇濃度對黃酮含量的影響 分別稱取米槁葉片粉末5g，按照液料比20∶1（mL∶g），提取時間30min，超聲功率為80W，超聲溫度為60℃，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%進行提取，考察不同乙醇濃度對黃酮含量的影響。

1.2.2.5 超聲溫度對黃酮含量的影響 分別稱取米槁葉片粉末5g，按照液料比20∶1（mL∶g），提取時間30min，超聲功率為80W，乙醇濃度為70%，超聲溫度分別為40、50、60、70、80℃，考察不同超聲溫度對黃酮含量的影響。

1.2.3 總黃酮含量測定

1.2.3.1 總黃酮標準曲線的繪制 標準曲線的繪制參考文獻[12，13]。得到線性回歸方程為：

1.2.3.2 樣品總黃酮含量的測定 測定方法參考文獻[14，15]。

總黃酮含量/%=C×D×V/（W×1000）×100%。式中 C：樣品中總黃酮濃度，mg·mL-1；D：樣品溶液稀釋倍數(shù)；V：供試品溶液體積，mL；W：樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 響應面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù) 根據(jù)單因素試驗結果，選取對實驗影響較大即提取時間、液料比、超聲功率,以黃酮含量為評價指標，采用三因素三水平響應面法對試驗進行設計，設計因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Tab.1 Test factor levels and codes

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同提取時間的影響

圖1為提取時間對米槁葉片黃酮含量的影響。

圖1 提取時間對米槁葉片黃酮含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由圖1可知，在固定其他條件下，提取時間在25~40min范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，黃酮含量越高。提取時間為40min時，黃酮含量達到最高值。45min時黃酮含量略有下降。原因可能是，隨著提取時間的增加，使得組織細胞破碎程度增加，其他易溶于乙醇的成分被提取出來，降低了黃酮的含量。

2.1.2 不同提取功率的影響

圖2為提取功率對米槁葉片黃酮含量的影響。

圖2 提取功率對米槁葉片黃酮含量的影響Fig.2 Effect of extraction power on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由圖2可知，在固定其他條件下，提取功率在20~80W范圍內(nèi)，隨著提取功率增加，黃酮含量升高。提取功率為80W時，黃酮含量達到最高值。當提取功率大于80W后，黃酮含量略有下降，原因可能是，由于超聲功率過高，使得溶劑溫度升高，破壞了米槁黃酮結構，從而使黃酮含量下降。

2.1.3 不同液料比的影響

圖3為液料比對米槁葉片黃酮含量的影響。

圖3 液料比對米槁葉片黃酮含量的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由圖3可知，在固定其他條件下，液料比在10∶1~30∶1（mL∶g）范圍內(nèi)，隨著提取時間增長，黃酮含量升高。液料比在30∶1（mL∶g）時黃酮含量達到最高值。超過30∶1（mL∶g）后黃酮含量略有下降，可能的原因是，隨著溶劑含量增加，其他易溶于乙醇的成分也被提取出來，從而使黃酮含量降低。

2.1.4 不同乙醇濃度的影響

圖4為乙醇濃度對米槁葉片黃酮含量的影響。

圖4 乙醇濃度對米槁葉片黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由圖4可知，固定其他條件下，在乙醇濃度為50%~70%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度增加，黃酮含量升高。乙醇濃度為70%時，黃酮含量達到最高值。當乙醇濃度升高，黃酮含量顯著下降。原因可能是，高濃度的乙醇會增加溶液的溶解度，使其他可溶性雜質(zhì)被提取出來，使黃酮含量降低。

2.1.5 不同提取溫度的影響

圖5為提取功率對米槁葉片黃酮含量的影響。

圖5 提取溫度對米槁葉片黃酮含量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由圖5可知，固定其他條件下，溫度在40~60℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度升高，黃酮含量升高。提取溫度在60℃時，黃酮含量達到最高值。超過60℃后，黃酮含量顯著下降。原因可能是，隨著溫度升高，使得部分黃酮類化合物結構改變，苯環(huán)被破壞，最終導致黃酮含量降低。

2.2 響應面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)結果

2.2.1 試驗設計及結果 根據(jù)單因素試驗結果，選取對實驗影響較大即提取時間、液料比、超聲功率,以黃酮含量為評價指標，采用三因素三水平Box-Behnken響應面法對試驗進行設計，Box-Behnken響應面試驗方案設計及結果見表2。

表2 響應面設計及結果Tab.2 Response surface design and results

2.2.2 建立響應面模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，以提取時間、液料比、超聲功率為考察因素，以黃酮含量為評價指標，對實驗結果進行回歸方程擬合得到回歸方程為：

黃酮含量%=1.03-0.05A+0.022B+5.75E-003C-0.025AB+0.021AC+9.5E-003BC-0.17A2-0.20B2-0.22C2（A、B、C分別代表提取時間、超聲功率、液料比），并對響應面模型進行方差分析及顯著性檢驗，結果見表3。

由表3可知，該模型P小于0.0001，說明此模型差異具有統(tǒng)計學意義，矯正系數(shù)R2adj=0.9923，預測復相關系數(shù)R2=0.9966，預測相關系數(shù)R2（Pred）=0.9560與預測復相關系數(shù)接近，說明偏差在合理范圍內(nèi)，實際值和預測值擬合度比較好。失擬項F=1.519E-003，P=0.0765，大于0.05不顯著，說明選擇的模型對該試驗的擬合度較好。變異系數(shù)C.V.%為2.19%，說明該模型相關性好，可用該擬合回歸方程對不同條件下米槁葉片黃酮的最佳得率進行分析。提取時間對米槁葉片黃酮得率影響較大，其次為超聲功率。由表3還可以看出，A、B、A2、B2、C2的P值小于0.01，AB、AC的P值小于0.05，以上因素對黃酮得率的影響顯著，其他因素對黃酮得率的影響不顯著。由F值可知，3個因素對米槁葉片黃酮得率的影響程度由大到小順序為：提取時間＞超聲功率＞液料比。

表3 方差分析及顯著性結果Tab.3 Analysis of variance and significance results

2.2.3 響應面參數(shù)優(yōu)化、預測與分析 采用Design-Expert 8.0.6.1軟件做超聲提取工藝參數(shù)的Box-Behnken響應面3D圖及等高線分析圖，見圖6。

由圖6可知，等高線越密集，中間形狀呈橢圓形或圓形，響應曲面越陡峭，說明該因素變化對響應值影響大，且兩因素之間的交互作用大，反之表明兩因素之間的交互作用對響應值的影響較小。通過其擬合圖形分析提取時間、超聲功率、液料比對黃酮含量的影響，結合表3的P值和圖6可知，A、B、A2、B2、C2的P值小于0.01，AB、AC的P值小于0.05，A和B對響應面弧面影響較大。通過求解回歸模型方程得到最佳超聲提取工藝參數(shù)為：提取時間39.87min、超聲功率為78.89W，液料比為29.72（mL∶g），黃酮含量為1.04%。

圖6 超聲提取工藝參數(shù)的Box-Behnken響應面3D圖及等高線分析圖Fig.6 Box-Behnken response surface 3D diagram and contour analysis diagram of ultrasonic extraction process parameters

2.2.4 工藝驗證 為檢驗試驗方法的可靠性，將對優(yōu)化后的工藝參數(shù)進行3次平行試驗，同時考慮到優(yōu)化實際操作的可行性，最終將實驗參數(shù)設定為：提取時間40min、超聲功率80W、液料比30（mg∶L），得到的黃酮含量為1.05%，與預測值1.04%相比偏差為0.01%，說明本實驗所建模型預測性較好且穩(wěn)定。故響應面值法優(yōu)化葉片黃酮超聲提取工藝參數(shù)的方法可行且穩(wěn)定。

3 結論

為了更好提取出米槁葉片中黃酮，本實驗以黃酮含量為評價指標，采用響應面法對超聲提取工藝的參數(shù)進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù)為提取時間40min、超聲功率為80W、液料比為30（mL∶g），得到黃酮含量為1.05%。