季歡歡 馮蒙蒙 李 靖 趙宗仁 董秋秀 鄭金玉 陳中俊

垂體腺瘤（pituitary adenoma，PA）是顱內(nèi)常見的良性腫瘤之一，約占顱內(nèi)腫瘤的15%。部分PA 呈侵襲性生長(zhǎng)，是臨床治療的一大難題，術(shù)后易復(fù)發(fā)。侵襲性PA的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因子參與、多因素相互作用的復(fù)雜過程，包括原癌基因激活、抑癌基因失活、細(xì)胞信號(hào)通路異常、染色體異常及血管生成因子改變等。Ras 相關(guān)蛋白R(shí)ab-1A（Ras-related protein Rab-1A，RAB1A）是一種高度保守的小鳥苷三磷酸酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸。有研究顯示，RAB1A作為癌基因在多種腫瘤中發(fā)揮作用，包括結(jié)直腸癌、膀胱癌和鼻咽癌等。也有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織RAB1A高表達(dá)，可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。本文探討RAB1A 在PA中的表達(dá)及其與腫瘤侵襲性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2018 年1 月至2021 年8 月手術(shù)切除的104 例PA 標(biāo)本，其中男59 例，女45 例；年齡28～71歲，平均（49.07±10.32）歲；腫瘤直徑8～49 mm，平均（28.01±8.51）mm；病理類型為混合型22 例，生長(zhǎng)激素型13 例，泌乳素型25 例，促腎上腺皮質(zhì)激素型10例，無功能型34例。根據(jù)Knosp分類法：侵襲性41 例，非侵襲性63 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理檢查證實(shí)為PA；年齡≥18歲；術(shù)前未接受過放/化療；病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染；合并其他部位腫瘤；合并代謝性疾??；合并免疫性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人或家屬簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)組織RAB1A 表達(dá) 組織經(jīng)10%中性福爾馬林（上海研生實(shí)業(yè)有限公司）固定后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度為4 μm）。檢測(cè)前用二甲苯脫蠟，乙醇水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（武漢博士德生物科技有限公司）進(jìn)行抗原修復(fù)，隨后用羊血清封閉。按照免疫組化SP 法檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）說明書操作。加兔抗人RAB1A 單克隆抗體（1:1 000，美國(guó)Sigma 公司），4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌后，滴加酶標(biāo)羊抗兔抗體（美國(guó)Sigma公司）室溫孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，最后中性樹膠封閉，顯微鏡下觀察。染色為棕黃色顆粒視為表達(dá)陽性（圖1），隨機(jī)選擇10 個(gè)顯微鏡下視野，每個(gè)視野隨機(jī)選100 個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行染色評(píng)分。染色強(qiáng)度的評(píng)分方法：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：<5%為0分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，>75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞比例評(píng)分相乘，≥4分為高表達(dá)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)垂體腺瘤組織RAB1A的表達(dá)（SP法，×400）

1.3 免疫印跡法檢測(cè)組織RAB1A 表達(dá) 隨機(jī)選取12例侵襲性PA組織和12例非侵襲性PA組織，用RAPI裂解液（上海尚寶生物科技有限公司）提取總蛋白，用10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF（上海尚寶生物科技有限公司）。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人RAB1A 單克隆抗體（1:1 000倍，美國(guó)Sigma 公司）4 ℃過夜孵育，用TBST緩沖液洗滌3 次后，加入羊抗兔二抗（美國(guó)Sigma 公司）室溫封閉1 h，ECL法進(jìn)行蛋白成像，Image J軟件分析灰度值。以β-actin作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件處理；計(jì)量資料以±

s

表示，用

t

檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用

χ

檢驗(yàn)；應(yīng)用多因素logistic 回歸模型分析侵襲性的影響因素；用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析RAB1A 鑒別PA 侵襲性的價(jià)值，計(jì)算曲線下面積、靈敏度和特異度；

P

<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA 組織RAB1A 表達(dá)水平的變化 侵襲性PA 組織中RAB1A 高表達(dá)率[65.85%（27/41）]明顯高于非侵襲性PA組織[36.51%（23/63）；

P

<0.05]。侵襲性PA組織RAB1A 蛋白相對(duì)表達(dá)量（2.87±0.54）明顯高于非侵襲性PA組織[（1.67±0.48）；

P

<0.05；圖2]。

圖2 免疫印跡法檢測(cè)垂體腺瘤組織RAB1A表達(dá)的電泳圖

2.2 PA侵襲性生長(zhǎng)的影響因素 單因素分析顯示，腫瘤直徑、RAB1A表達(dá)水平與PA侵襲性有關(guān)（

P

<0.05，表1）。多因素logistic回歸分析顯示腫瘤直徑≥3 cm（OR=2.342；95%CI 1.003～5.903；

P

<0.001）、RAB1A高表達(dá)（OR=1.908；95%CI 1.004～3.786；

P

=0.003）是PA侵襲性生長(zhǎng)的獨(dú)立影響因素。

表1 垂體腺瘤侵襲性生長(zhǎng)影響因素的單因素分析（例）

注：與非侵襲性組相應(yīng)值比，*<0.05

危險(xiǎn)因素性別侵襲性（n=41） 非侵襲性（n=63）男女年齡21 20 35 28≥60歲<60歲腫瘤直徑≤1 cm 1～3 cm≥3 cm腫瘤囊性變病理類型無功能型ACTH型泌乳素型生長(zhǎng)激素型混合型RAB1A表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)9 32 25 38 07 34（82.93%）*7 18 32 13（20.63%）10 12 4 11 68 23 6 14 7 13 27（65.85%）*14 23（36.51%）40

2.3 ROC曲線分析結(jié)果RAB1A表達(dá)水平鑒別PA侵襲性生長(zhǎng)的曲線下面積為0.851，靈敏度、特異度分別為85.13%和79.12%。見圖3。

圖3 ROC曲線分析RAB1A鑒別垂體腺瘤侵襲性生長(zhǎng)的效果

3 討論

臨床上，部分PA 會(huì)侵襲周圍組織，全切除較困難，術(shù)后易復(fù)發(fā)。近年來，越來越多研究開始關(guān)注侵襲性PA 的生物學(xué)標(biāo)志物，包括影像學(xué)指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)、分子生物學(xué)指標(biāo)。RAB1A 是RAS 小G 蛋白家族成員之一，參與細(xì)胞增殖、侵襲、分化和凋亡等。有研究發(fā)現(xiàn)RAB1A 可通過IL-4R/JAK1/STAT6 信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲。本文侵襲性PA組織RAB1A表達(dá)水平明顯高于非侵襲性PA組織；多因素logistic回歸分析顯示，RAB1A是PA侵襲性生長(zhǎng)的獨(dú)立影響因素；ROC 曲線分析顯示RAB1A 鑒別PA 侵襲性生長(zhǎng)的曲線下面積為0.851，靈敏度、特異度分別為85.13%和79.12%。這提示RAB1A對(duì)評(píng)估PA的侵襲性有一定價(jià)值。

本研究也存在一些局限性，例如未分析RAB1A下游信號(hào)通路的變化；未分析RAB1A 與PA 增殖和凋亡的變化；未對(duì)病人進(jìn)行隨訪，未能明確RAB1A與PA預(yù)后的關(guān)系。未來需要開展細(xì)胞和動(dòng)物研究，深入分析RAB1A與PA的關(guān)系。

總之，RAB1A 的表達(dá)水平與PA 的侵襲性有關(guān)，檢測(cè)RAB1A可輔助評(píng)估PA的侵襲性。