李劍慶 王 慧 劉 雨 譚光波▲

慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有較高發(fā)病率及死亡率，是世界范圍內導致死亡的主要原因之一，世界衛(wèi)生系統(tǒng)為此耗費大量的醫(yī)療資源[1]。COPD 以持續(xù)的呼吸困難、咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀和進行性氣流阻塞為主要臨床特征，是可預防和治療的疾病。目前公認吸煙是導致COPD 的主要原因，但不是唯一的原因[2]。COPD具有多種致病機制，如彈性蛋白酶活性過高、氧化應激、細胞凋亡和自身免疫等[3]。當前，COPD 的診斷主要仍依賴于檢測氣流受限程度，治療手段主要包括使用支氣管擴張劑、吸入糖皮質激素等以改善氣流受限和減輕癥狀，但對延緩疾病惡化的效果并不十分理想[4]，且副作用較多。以支氣管擴張劑對癥治療并不能從根本上減輕持續(xù)氣道炎癥引起的肺氣腫進展[5]。目前西藥對COPD 穩(wěn)定期患者的治療效果和安全性欠佳，長期吸入支氣管擴張劑和糖皮質激素的維持療效有限[6，7]。相比之下，中醫(yī)藥在COPD 的治療中顯示出一定的優(yōu)勢，能明顯改善COPD 患者的臨床癥狀，且安全性可觀，患者較易接受。尋找具有多靶點、多層次的中藥配合治療COPD具有重要意義。

補肺湯出自《永類鈐方》，方由桑白皮、熟地黃、人參、紫菀、黃芪、五味子組成，主治勞嗽，其組方特點在于肺腎雙補、金水相生，無論是肺虛在先，引起腎虛，還是腎虛在先，繼而肺虛，均可收效。其對于慢性肺系疾病遷延不愈、肺腎兩虛者療效甚佳。臨床上，補肺湯能有效緩解COPD患者的癥狀，改善肺功能，提高患者的運動耐量和生活質量。但其確切作用機制迄今尚不清楚。中藥組方是由多種中草藥共同構成的，其化學成分多樣而復雜，尋找特定有效的療效靶點是一項亟待解決的任務。網絡藥理學是系統(tǒng)研究中藥配方的關鍵技術手段之一，其可以揭示草藥和配方的藥理作用，以及基于多學科整合的分子機制，如高通量組學、計算機技術、藥理學和網絡數(shù)據(jù)庫檢索[8，9]。本研究應用網絡藥理學及生物信息學技術預測補肺湯治療COPD的藥效物質基礎和分子機制，從中藥組方多靶點、多通路入手，探討補肺湯治療COPD潛在的作用機制，為開展關于補肺湯的基礎實驗和臨床應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩選補肺湯的活性成分及相關靶點以“黃芪、桑白皮、熟地、人參、紫菀、五味子”為檢索詞，使用ADME參數(shù)篩選，以類藥性（DL）≥0.18及口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件，檢索時間為2021年9月，在TCMSP數(shù)據(jù)庫[10](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.ph)中檢索補肺湯的中藥及其活性成分，并基于TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺，找到有效成分所對應的相關靶點。因桑白皮在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未查及，選用TCMBAT 數(shù)據(jù)庫[11]（bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），以Score cutoff≥30，Adjusted P-value<0.05 篩選，獲得有效成分及相應的靶點。

1.2 利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對潛在靶點進行標準化TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得的蛋白靶點名稱多樣且冗長，為了將所獲得的目標靶點名稱規(guī)范化，將檢索的每味中藥的靶點取合集，整合出補肺湯的潛在靶點，并利用UniProt 數(shù)據(jù)庫[12](http://www.uniprot.org/) 中 的UniProtKB 功能，按照“Reviewed”“Human”篩選，將以上獲得的補肺湯潛在蛋白靶點名稱與數(shù)據(jù)庫一一配對，一并轉換為Gene symbol，即相應基因名稱。

1.3 篩選COPD 的疾病相關預測靶點以“COPD”及“chronic obstructive pulmonary disease”作為關鍵詞進行檢索，利用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫[13]（www.disgenet.org/），以閾值score>0.9 為篩選條件獲取疾病靶點；利用Genecards 數(shù)據(jù)庫[14]（www.genecards.org/），設置閾值Relevance score>20 為篩選條件獲取疾病靶點；基于GEO數(shù)據(jù)庫[15]篩選COPD差異基因，以“Homo sapiens”為組織來源，篩選正常人作為對照組，同時臨床樣本為肺泡灌洗液、血清、肺組織的數(shù)據(jù)集，最終選用GSE 76925 和GSE 106986 兩組數(shù)據(jù)集，并以adj.P.Val<0.05、差異倍數(shù)≥4 為篩選條件，獲得表達差異基因靶點。最后將差異表達基因與另外兩個數(shù)據(jù)庫收集的疾病靶點合并，刪除結果中重復的靶基因后，作為COPD疾病預測靶點。

1.4 構建“藥物靶點-疾病靶點”交集，獲取核心靶點采用Venny 2.1 繪圖工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將上述獲得的藥物治療COPD潛在靶點與疾病預測靶點取交集，生成韋恩圖，獲得補肺湯治療COPD的核心靶點。

1.5 構建“藥物-有效成分-核心靶點-疾病”網絡圖，獲取關鍵靶點為了進一步明確補肺湯治療COPD的核心靶點間相互作用關系，將獲得的核心靶點上傳到String 數(shù) 據(jù) 庫[16]（cn.string-db.org/），選 擇“Homo sapiens”，以score≥0.7為篩選條件，獲得核心靶點互作關系數(shù)據(jù)圖，并將獲得的互作數(shù)據(jù)集和上述篩選的中藥成分及靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.2。利用Cytoscape 3.8.2 的Network Analysis 進行網絡拓撲分析，構建可視化互作圖。針對核心靶點，按照Degree值，篩選出≥2倍中位數(shù)的核心靶點，再用cytohubba程序按從大到小選取該排名前30的結果作為關鍵靶點。

1.6 核心靶點的GO功能注釋和關鍵靶點的KEGG通路富集為了進一步了解生物學功能，將核心靶點和關鍵靶點分別導入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫[17]（david.ncifcrf.gov）。對核心靶點進行GO功能注釋，對關鍵靶點進行KEGG通路分析，均以FDR<0.05（即校正P值）為篩選條件，獲得GO和KEGG富集分析數(shù)據(jù)，并將結果繪制成柱狀圖或氣泡圖。

2 結果

2.1 補肺湯的活性成分和潛在靶點通過對TCMSP和TCMBAT數(shù)據(jù)庫檢索，篩選符合檢索標準的有效成分，得到黃芪20個成分、熟地黃2個成分、五味子8個成分、人參22個成分、紫菀19個成分、桑白皮17個成分。收集有效成分相應的預測靶點，合并去重后，共獲得補肺湯潛在靶點354個。

2.2 COPD 疾病預測靶點的篩選通過對3 個疾病靶點數(shù)據(jù)庫的檢索，篩選符合檢索標準的疾病預測靶點，共獲得DisGeNET預測靶點900個、Genecards預測靶點1169 個、GEO 差異表達基因140 個。合并去重后，共獲得與COPD相關的疾病預測靶點1716個。

2.3 “藥物-有效成分-靶點-疾病”的數(shù)據(jù)整理與調控網絡的構建利用Venny 2.1作圖工具，將上述獲得的補肺湯潛在靶點與COPD 疾病預測靶點取交集，共獲得143 個核心靶點（見圖1）。將143 個核心靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，獲得PPI 數(shù)據(jù)圖（見圖2），結果共有143個節(jié)點，產生了1017條邊。將蛋白互作數(shù)據(jù)與上述獲得的中藥、有效成分及預測靶點一并導入Cytoscape 3.8.2，構建“藥物-有效成分-核心靶點-疾病”網絡圖（見圖3）。其中各節(jié)點的大小與度值大小呈正相關，節(jié)點連接度（degree）越大，節(jié)點越大，發(fā)生的反應越多，靶點可能越具有重要作用。通過網絡拓撲結構分析發(fā)現(xiàn)，Degree 排名前5 位的藥物活性成分分別是：槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、木犀草素（MOL000006）、異鼠李素（MOL000354）、β-谷甾醇（MOL000358）。按degree 大小取前10 個活性成分作表展示（見表1）。

圖1 補肺湯-COPD靶點韋恩圖

表1 Degree值前10個活性成分

圖2 核心靶點PPI數(shù)據(jù)圖

圖3 “藥物-有效成分-核心靶點-疾病”網絡圖

2.4 核心靶點GO 功能分析將核心靶點上傳到DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進行GO功能分析，其中包括分子功能(Molecular Function，MF)、細 胞 組 分(Cellular Component，CC)、生物學過程(Biological Process，BP)。結果顯示，顯著富集到生物過程的共計289個，主要涉及對缺氧的反應、對凋亡過程的負調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調控、基因表達的正向調控、外源性凋亡信號通路、對脂多糖的反應、衰老等；顯著富集到細胞組分的共計31個，主要涉及細胞質、膜筏、受體復合體、質膜、內質網腔、血小板α顆粒管腔、胞外區(qū)等；顯著富集到分子功能的共計46個，主要涉及酶結合、蛋白結合、蛋白同源二聚體活性、藥物結合、轉錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合、細胞因子活性等。選取各類GO富集前十位結果進行圖表展示，見圖4～6。

圖4 分子功能（MF）

圖5 細胞組分（CC）

圖6 生物學過程（BP）

2.5 關鍵靶點KEGG 信號通路分析應用Cytoscape 3.8.2 中cytohubba 進行關鍵靶點篩選，按照Degree 值≥2 倍中位數(shù)（即Degree≥44），得到核心靶點共37個，再從中選取排名前30的靶點作為關鍵靶點，分 別 為TNF、AKT1、TP53、JUN、IL6、EGFR、IL1B、RELA、VEGFA、CASP3、MAPK1、MMP9、MYC、IL10、CXCL8、STAT1、ESR1、MAPK14、EGF、HIF1A、CCL2、MAPK8、NFKBIA、CCND1、FOS、AR、IL2、CAV1、CASP8、PTGS2。為了進一步明確關鍵靶點所起的重要作用，將關鍵靶點上傳到DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 信號通路富集分析。結果顯示，顯著富集的通路主要涉及TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路、單純皰疹病毒感染、癌癥信號通路等共計110個。據(jù)FDR列出排名前15的信號通路作圖，見圖7。

圖7 KEGG通路富集

3 討論

COPD 的主要特征為進行性氣流受限，主要表現(xiàn)為進行性的胸悶、喘息或伴咳嗽、咳痰，臨床多以虛證為主，虛實夾雜。補肺湯是臨床上常用來治療COPD肺腎兩虛證患者的有效方劑，由桑白皮、熟地黃、人參、紫菀、黃芪、五味子組成。其中人參歸脾、肺、心經，可大補元氣、益肺生津；熟地黃歸肝、腎經，可滋腎水，補真陰，俾金水相生；黃芪補氣固表以御外邪；紫菀、桑白皮下氣消痰以祛邪；再合五味子酸斂肺氣。全方肺腎雙補，攻補兼施，散中有收，故對COPD 肺腎兩虛證患者有穩(wěn)定的療效。目前關于補肺湯治療COPD的作用機理尚不甚明確，中藥組方存在多種化學成分相互作用、相互調節(jié)，其中成分多而復雜，深入研究其發(fā)揮作用的具體成分和靶點具有重要意義。

通過對“藥物-有效成分-靶點-疾病”的網絡構建與分析，發(fā)現(xiàn)度值排名前5的有效成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素和β-谷甾醇。目前關于槲皮素的研究較多，已知槲皮素屬于植物類黃酮化合物，其廣泛分布于植物中，包括蘋果、葡萄、洋蔥、茶、西紅柿和銀杏等，是一種有效的抗氧化和抗炎劑[18]?；|金屬蛋白酶（MMPs）在COPD患者中表達增加，在肺氣腫的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。有研究顯示，在彈性蛋白酶或脂多糖處理的肺氣腫小鼠中，槲皮素能明顯抑制MMP9 和MMP12 的水平，并降低MUC5AC mRNA 表達，改善肺部氧化應激和炎癥，防止肺氣腫的進展[19]。急性加重是COPD 患者發(fā)病和死亡的主要原因，鼻病毒感染可能加速COPD患者肺部疾病的進展。在一項對鼻病毒感染小鼠模型的研究中，與對照組相比，槲皮素處理的小鼠能減輕鼻病毒感染引起的肺彈性回縮、肺部炎癥、杯狀細胞化生，同時能抑制巨噬細胞和CD8+T細胞在肺部的聚集，提示槲皮素能有效地減緩鼻病毒誘導的COPD小鼠模型肺部疾病的進展[20]。另外，目前糖皮質激素抵抗也是COPD 治療過程中亟待解決的問題，香煙煙霧（CS）造成的慢性炎癥和氧化應激很可能導致這種皮質類固醇的耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）暴露下的u937細胞（人類單核細胞）會降低對皮質類固醇的敏感性，而槲皮素處理后則顯著逆轉了這種效果，恢復到非刺激細胞對皮質類固醇反應性的相同水平[21]，提示槲皮素在治療COPD耐藥等方面有可能成為一種新的治療藥物。山奈酚也具有顯著的抗炎作用，有研究顯示，山奈酚對NF-kB與氧化應激的激活有明顯的抑制作用[22]。有研究者還發(fā)現(xiàn)，山奈酚能通過阻斷Tyk-STAT信號通路，明顯抑制LPS誘導的氣道上皮細胞炎癥反應[23]。促炎細胞因子和趨化因子(TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)廣泛參與COPD的發(fā)病[24]，木犀草素和異鼠李素則能通過降低肺損傷小鼠血清及BALF 中IL-1β、IL-6、TNF-α水平以減輕肺損傷程度[25，26]。補肺湯可能通過減輕氣道炎癥、氧化應激及調節(jié)免疫和對皮質醇的敏感性在COPD聯(lián)合治療中發(fā)揮療效。

在對核心靶點的GO功能分析中發(fā)現(xiàn)，補肺湯治療COPD可能通過調控組織缺氧、負調控細胞凋亡、對脂多糖的反應以及細胞衰老等生物過程改善COPD的發(fā)生、發(fā)展。其中關鍵靶點包括TNF、AKT1、TP53、JUN、IL6、EGFR、MMP9、NFKBIA、MAPK1等，大多已經被證實在COPD 的發(fā)病機制中具有重要作用。進一步的KEGG 信號通路分析發(fā)現(xiàn)，補肺湯還可能通過調控TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路、單純皰疹病毒感染等途徑在COPD的治療上起作用。得益于廣大科研人員的探索，這些關鍵靶點與信號通路在COPD發(fā)病中的作用也逐步被人們了解。

眾所周知，NFκB在促進炎癥產生的過程中至關重要，是最重要的炎癥信號通路之一。長期暴露于CS會使肺組織內的NF-κB過度激活，從而進一步誘導下游炎癥級聯(lián)反應的產生，導致氣道重塑加重和COPD 臨床癥狀反復[27，28]。補肺湯可能通過調控NF-κB的活化以減輕肺部炎癥。TNF-α是一種多效性細胞因子，可啟動許多下游信號通路，包括NF-κB激活、MAP 激酶激活以及誘導凋亡、壞死和活性氧的產生[29]。有研究利用TNF-α轉基因小鼠在肺部過度表達TNF-α，進而促使小鼠出現(xiàn)COPD 類似的肺氣腫改變，提示TNF-α在COPD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[30]。彈性蛋白酶與抗彈性蛋白酶失衡是COPD 的公認機制之一，肺組織彈性蛋白裂解失控會使肺泡失去彈性，加重結構破壞，進而導致肺氣腫的產生?；|金屬蛋白酶（MMPs）是一組能夠降解多種細胞外基質的內切蛋白水解酶，其中MMP-9是該家族中主要的促彈性組織解離的酶，能直接誘導肺內彈性蛋白的降解，導致膠原蛋白的減少而出現(xiàn)肺氣腫[31]。補肺湯可能通過下調MMP-9、TNF-α的表達而進一步抑制肺組織彈性蛋白的降解以延緩COPD肺氣腫的進展。

Toll樣受體（TLRs）是一組細胞表面和亞細胞跨膜蛋白，屬于宿主先天免疫系統(tǒng)的模式識別受體(PRRs)類，在識別細菌、病毒等微生物病原體時起到傳導的作用。病原體相關分子模式(PAMPs)可以通過與TLR結合，誘導下游特定的信號級聯(lián)反應（包括激活NF-κB、MAP 激酶和IRF 信號通路等），以調節(jié)先天和獲得性免疫、組織修復和再生過程[32]。近來的研究表明，TLRs在COPD發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色，其中TLR-4在維持COPD 炎癥反應中顯得更為重要[33]。CS 與TLRs作用后，促發(fā)跨膜信號轉導，再通過激活NF-κB通路誘導釋放IL-6、IL-8、COX-2、PGE2等大量炎性因子。這些炎癥因子一方面可引起局部細胞直接損傷，另一方面還可作為內源性配體募集炎癥細胞，形成炎癥正反饋循環(huán)，從而放大和維持肺部炎癥[34]。NOD樣受體，與Toll 樣受體類似，也是機體固有免疫應答的重要組成部分，能夠識別PAMPs 或內源性損傷相關分子模式（DAMPs），進而通過活化PRR來調控炎癥反應。在關于NOD樣受體的研究中，又以對NLRP3炎性小體的認識較為深入。NLRP3炎性小體主要由三部分組成，即NLRP3 蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白（CARD）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前體蛋白（pro-caspase-1）。在經過一系列上游信號傳導與pro-caspase-1招募后，被激活的caspase-1將促炎因子（主要為IL-1β和IL-18）前體剪切加工成為成熟體，再釋放至細胞外，進而引起炎性反應[35]。然而若caspase-1活化過多，引起炎性細胞因子過度分泌，可發(fā)生細胞炎癥性死亡，進而產生細胞因子風暴，加重炎癥損傷，導致細胞焦亡[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，同樣暴露于CS下，與對照組相比，NLRP3基因敲除組小鼠肺組織中caspase-1活化、IL-18表達水平及炎癥損傷均較野生型正常小鼠明顯降低，表明炎癥小體在CS誘導的氣道炎癥中具有關鍵作用[36]。同時也有研究[37]報道，COPD患者痰液和血清中IL-18、IL-1β及肺組織中NLRP3 mRNA的表達均顯著高于對照組，并且與COPD穩(wěn)定期相比，急性加重期患者血清IL-1β水平明顯升高。補肺湯可能通過調控NOD樣受體、Toll樣受體及細胞焦亡途徑以改善COPD患者的肺部持續(xù)的炎癥損傷，對戒煙后的COPD持續(xù)狀態(tài)可能有益。

MAPKs 信號通路主要由P38MAPK、JNK 以及ERK1/2 這3 條信號通路組成。MAPKs 廣泛參與細胞的生長繁殖、分裂死亡以及細胞內各種生化反應過程中。有文獻[38]證實，JNK和p38MAPK的激活會促使細胞凋亡，而ERK1/2的激活會抑制細胞凋亡。進一步研究[39]顯示，CSE 誘導的A549 細胞ERK、JNK 和p38MAPK磷酸化水平顯著升高，并且肺泡上皮細胞凋亡增加[39]，提示MAPK 通路的激活與肺泡細胞凋亡有關。補肺湯可能通過抑制肺泡細胞凋亡阻止肺內氣道破壞與重構，以改善患者氣流受限。

綜上所述，通過對補肺湯的網絡藥理學和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)其作用于COPD 的主要有效成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素和β-谷甾醇等，關鍵靶點主要包括TNF、AKT1、TP53、JUN、IL6、EGFR、MMP9、NFKBIA、MAPK1等，參與的重要信號通路包括TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路等，涉及的生物過程主要為組織缺氧、細胞凋亡、衰老及對脂多糖的反應等。該網絡藥理學分析為補肺湯治療COPD 提供了一定的理論依據(jù)，但研究也存在一定缺陷，包括各類數(shù)據(jù)庫收錄的信息有限、數(shù)據(jù)更新不及時、有些尚未經過驗證等，故這些結果需要在后續(xù)的臨床和基礎研究中進一步證實。