宋瑞，錢航，李東鋒，陳繼舜，閔新文，楊漢東，陳俊，許浩

(1.錦州醫(yī)科大學國藥東風總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地；2.湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院心內科，湖北 十堰 442008)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)是全球致殘和死亡的主要原因之一[1]。動脈粥樣硬化是CHD的主要病理機制，是一種以脂肪堆積、平滑肌細胞增殖、細胞凋亡、壞死、纖維化和局部炎癥為特征的慢性炎癥性疾病[2]。動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展是一種多因素的復雜過程，與吸煙、飲酒等生活方式有關，也與高血脂、高血糖、遺傳等因素密切相關。既往研究表明,糖脂代謝紊亂在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用[3]。

胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)G蛋白偶聯(lián)受體B家族，主要分布胰腺、肺、心臟、腎臟、血管平滑肌、脂肪細胞、胃腸道及中樞神經系統(tǒng)等[4]。研究表明，胰高血糖素樣肽-1受體激動劑(GLP-1RA)促使GLP-1R與胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)結合，使其半衰期延長，發(fā)揮活性GLP-1作用，主要通過減少炎性細胞、抑制炎性因子的釋放和改善氧化應激，降低內皮細胞的損傷，改善內皮細胞功能，從而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展；并通過抑制巨噬細胞的浸潤、鈣沉積、細胞外基質重構及血管平滑肌細胞增殖，可以限制斑塊進一步增厚和破裂[5]。目前GLP-1R基因多態(tài)性作為糖尿病治療的重要靶點的研究較為廣泛，但關于其與冠心病發(fā)病風險及影響血脂水平方面的研究報道較少。本研究分析了GLP-1R基因rs3765467基因多態(tài)性與冠心病患病風險的關系，進一步對冠心病的早期識別以及相關基因靶點藥物治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料對象

收集2020年7月至2021年5月，在湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院心內科，住院已經行選擇性冠脈造影檢查的病人的臨床資料及血液樣本，共280例，以冠脈造影檢查發(fā)現(xiàn)冠狀動脈主支狹窄程度≥50%為診斷冠心病的標準；以冠狀動脈造影未見明顯冠狀動脈狹窄為對照組的標準。根據造影結果分為對照組(n=148例)及病例組(CAD，n=132例)。

排除標準：(1)既往心肌梗死；(2)急性心衰；(3)白血病；(4)多發(fā)性骨髓瘤；(5)貧血；(6)甲狀腺疾??；(7)感染性疾??；(8)急慢性肝腎功能不全及其他影響腎功能疾??；(9)免疫性疾??；(10)腫瘤。

本研究經湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，每例病人均在在入組前知曉檢測目的并簽署知情同意書。

1.2 標本的收集與保存

禁食12～14 h后，次日清晨采肘靜脈血2管，各5 mL。其中1管使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，用來提取基因組DNA；另1管為促凝管，分離血清后用于生化指標檢測，生化指標包括：總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白a(ApoA1)、載脂蛋白(ApoB)。

1.3 基因多態(tài)性的檢測

按照 TIANGEN 試劑盒說明方法提取外周血DNA，運用超微量紫外分光光度計測定其DNA的濃度和純度，濃度大于20 ng/μL，并記錄DNA原液濃度并對應編號，放置于-80 ℃冰箱待測。在NCBI數據庫下載rs3765467位點500 bp左右的基因序列，引物設計軟件Pimer 5.0設計下列引物：GLP-1R-rs3765467位點引物序列如下：上游引物5′-GCAGGGATAGCCCTCAGAAT-3′；下游引物5′-TGTTCCAAGGCCAGAGGT-3′，引物由生工Sangon Biotech公司進行合成。取2 μL提取DNA樣品最終配成25 μL反應體系(GLP-1R基因、Primer 1、Primer 2、2×PCR mix、ddH2O)置于PCR儀中，PCR程序設定為：預變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火50 ℃～65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；終延伸72 ℃ 5 min；反應結束后取5 μL反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳；經瓊脂糖鑒定無誤后，將擴增產物送至生工Sangon Biotech公司進行測序，隨后進行測序結果分析。

1.4 觀察指標

(1)比較兩組一般資料、BMI、高血壓病史及血脂水平；(2)兩組 GLP-1R rs3765467 位點基因分型及各基因頻率分布；(3)比較病例組GLP-1R rs3765467基因多態(tài)性與血脂水平之間關系；(4)通過Logistic回歸分析，分析基因多態(tài)性與CHD患病發(fā)生的關系。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 兩組患者一般資料及生化指標比較

與對照組相比，病例組中年齡、性別比例、吸煙比史、BMI、TC、LDL-C、ApoA1、既往高血壓病史差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 一般資料及生化指標比較

2.2 兩組研究對象GLP-1R rs3765467基因分型及各基因頻率分布

經SNPscanTM分型技術對rs3765467位點進行基因型鑒定，該位點有3種基因型，分別為TT、CT、CC。GLP-1R rs3765467基因位點在對照組與病例組中基因頻率分布均符合哈迪溫伯格(H-W)平衡，可代表整體，進行遺傳分析。見表2，rs3765467在對照組與病例組基因型與等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

2.3 病例組GLP-1R rs3765467基因多態(tài)性與血脂水平關系

對病例組人群進行GLP-1R rs3765467位點多態(tài)性與血脂水平之間的分析。GLP-1R rs3765467位點時，對照組TT+TC基因型TG水平明顯高于攜帶CC基因型人群，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中女性攜帶TT+TC基因型比攜帶CC基因型具有更高TG(P<0.05)，見表3。

表3 病例組rs3765467基因多態(tài)性與血脂水平關系

2.4 Logistic回歸分析

排除傳統(tǒng)冠心病發(fā)病危險因素(年齡、性別、吸煙史、BMI、高血壓、血脂、2型糖尿病)，通過Logistic回歸分析，rs3765467位點中 TT基因型是冠心病的發(fā)病的獨立危險因素，攜帶 TT基因型患CAD風險是CT/CC基因型攜帶者的 4.681倍(OR=4.681，95%CI：1.017～21.534，P=0.047)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。攜帶TT基因型患冠心病風險是CT基因型攜帶者的4.79倍(OR=4.790，95%CI：1.017～22.573，P=0.048)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 Logistic回歸分析結果

3 討 論

人類GLP-1R基因由13個外顯子和12個內含子組成，位于6號染色體p21.1帶，其長度為38.9 kb。GLP-1R與GLP-1結合，激活后可以通過升高細胞內環(huán)磷酸腺苷水平、細胞內鈣離子含量，導致葡萄糖依賴性胰島素釋放，從而起到降糖作用[6]。同時作用于下丘腦，通過降低食欲、增加飽腹感、增強肝臟脂肪酸氧化以及延緩胃排空等作用，降低體脂水平[7]。既往研究表示，GLP-1R 基因多態(tài)性與空腹血糖、BMI、胰島功能、營養(yǎng)攝入等有關，在不同人群中 GLP-1R 基因不同位點的突變可引起酪氨酸磷酸化障礙，導致胰島素分泌量改變，從而影響血糖水平[8]。本研究分析 GLP-1R 基因 rs3765467 位點多態(tài)性分布特征，上述數據表明，GLP-1R 基因 rs3765467 位點存在多態(tài)性，但在對照組與病例組中等位基因與基因型分布無顯著性差異。在病例組GLP-1R 基因rs3765467位點突變型血脂TG水平明顯高于純合子攜帶人群，與李蕊等[9]研究發(fā)現(xiàn)一致，rs3765467位點突變型的TG水平明顯高于純合子，但其研究等位基因與基因型分布存在明顯差異，考慮可能由于樣本量不足、種群及納入人群有關。

在心血管系統(tǒng)方面，GLP-1受體激動劑可以通過降低餐后血脂、降糖、抑制心肌氧化應激和抗炎、改善血管內皮、控制血壓及體重減輕，對心血管起到間接或直接保護作用[10]。在動脈粥樣硬化形成過程中，GLP-1受體激動劑還可通過抑制斑塊進展、改變斑塊組成成分及維持斑塊穩(wěn)定[11]。高脂血癥是冠心病發(fā)病主要危險因素[12]。B.Vergès等[13]研究顯示，GLP-1受體激動劑可以降低TC、載脂蛋白B-48和載脂蛋白C-Ⅲ。既往研究中表明，使用兩種不同GLP-1受體激動劑后可觀察到兩種藥物均可以降低餐后血脂[14]。GLP-1R受體激動劑通過調節(jié)胰島素抵抗，影響血脂水平，平衡糖脂代謝關系，起到抑制冠心病發(fā)生。本研究表明，攜帶 TT基因型患CAD風險是CT/CC基因型攜帶者的 4.681倍，表明GLP-1R基因rs3765467位點多態(tài)性與冠心病發(fā)病風險相關，為冠心病基因遺傳學方面研究，提供新思路。

目前發(fā)現(xiàn)與 GLP-1R 功能改變有關的 SNPs 主要位點：rs6923761、rs3765467、rs4714210、rs103 05492、rs367543060、rs742764、rs10305420和rs 2254336。de Luis DA等[15]在肥胖人群一項研究中發(fā)現(xiàn)，GLP-1R rs6923761 與G等位基因攜帶者相比，A等位基因攜帶者其體質指數、脂肪量、腰圍、TG和HDL-c水平明顯減低。 2型糖尿病患者中 GLP-1R rs3765467位點突變型患者對DPP-4抑制劑的應答比例更高，糖化血紅蛋白下降幅度也更大[16]。在對日本普通人群的橫斷面研究[17]中，rs3765467多態(tài)性人群在營養(yǎng)攝入后，消耗營養(yǎng)過程中有較好的促胰島素作用，可誘導胰島素分泌增加>100%。在GLP-1R SNPs的研究中發(fā)現(xiàn)[18]，rs3765467和rs10305492 基因位點對β細胞的胰島素分泌能力和β細胞質量有重要的調節(jié)作用，可能通過使β細胞的功能障礙和凋亡而影響GLP-1與GLP-1R的相互作用,從而進一步降糖。提示 GLP-1R 基因 rs3765467 位點多態(tài)性可能影響血糖水平。

現(xiàn)在關于GLP-1R rs3765467基因多態(tài)性方面研究還包括了神經系統(tǒng)疾病。Qiu[19]在中國漢族人群研究中得出，GLP-1R rs3765467基因多態(tài)性是帕金森病的潛在危險因素，尤其是男性和晚發(fā)帕金森病患者。在低體重兒預喂養(yǎng)GLP-1，其水平升高可能損害下丘腦和外周GLP-1R信號，對下丘腦核調節(jié)能量穩(wěn)態(tài)產生長期的負面影響，增加肥胖和糖尿病的風險[20]。

根據以上研究可知，GLP-1R 基因rs3765467位點具有基因多態(tài)性，且多態(tài)性可能引起血糖、血脂、胰島素分泌的改變。目前研究推測GLP-1R基因的異常表達由于基因突變可能導致，從而增加冠心病的患病風險。影響主要集中在調節(jié)糖脂代謝紊亂、改善炎癥反應等方面，本次研究樣本量較少，基因位點單一，可通過擴大樣本標本進一步研究GLP-1R多個基因多態(tài)性與高脂血癥、2型糖尿病患病風險之間的關系。