王月，王凌冰

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

腦出血是常見急性腦血管性疾病，我國約18.8%～47.6%的卒中患者為腦出血，該病病情兇險、變化快，致殘和致死率高，死亡率可高達(dá)30%～50%[1]。腦出血后形成的血腫占位效應(yīng)、血腫促進(jìn)周圍腦組織釋放的血管活性物質(zhì)、凝血酶級聯(lián)放大反應(yīng)、補(bǔ)體系統(tǒng)激活以及血腫分解產(chǎn)物均能夠通過誘發(fā)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡造成腦組織損傷，進(jìn)而降低患者神經(jīng)功能[2]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)屬于促炎因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞等，研究顯示腦出血患者血腫周圍腦組織IL-6表達(dá)升高，高水平IL-6能夠誘導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)激活，進(jìn)一步加重腦組織損傷和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[3]。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子-3(SOCS-3)能夠通過JAK/STAT通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)IL-6表達(dá)并促進(jìn)Th細(xì)胞生成和活化，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[4]。鼠神經(jīng)生長因子(NGF)能夠保護(hù)感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元，減輕腦組織損傷程度，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生和生長，有助于神經(jīng)功能恢復(fù)，目前已經(jīng)在神經(jīng)中毒、周圍神經(jīng)損傷、顱腦外傷等疾病治療中得以應(yīng)用[5]。但目前關(guān)于NGF在腦出血治療中的應(yīng)用效果及相關(guān)機(jī)制研究較少，本研究采用腹腔注射NGF治療對尾狀核腦出血大鼠，觀察腦組織炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡及IL-6、SOCS-3的影響，以探討NGF對腦出血后腦損傷的改善效果和作用機(jī)制。現(xiàn)將研究內(nèi)容和結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選擇60只成年雄性SD大鼠，體重305～360 g，采用隨機(jī)分組飼養(yǎng)，用動物實驗中心的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)溫度保持在20～25 ℃。采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組和NGF組，各20只。

1.2 模型建立及分組處理方法

非肝素化自體鼠尾血注入法建立的尾狀核腦出血模型，具體方操作參照Xue M[6]等的方法：術(shù)前禁食12 h、禁水4 h，大鼠稱重后，予以腹腔注射400 mg/kg水合氯醛(10%，m/v)，麻醉成功后調(diào)整俯臥位并固定在定位儀上，保持頭部正中位，前囟和后囟處于同一平面，并保持大鼠耳間線平面比其門齒鉤平面高2.5 mm左右。剔除大鼠頭頂毛發(fā)，碘伏消毒局部皮膚，以前囟中央作為原點，在前囟前約0.2 mm、中線向右旁約3.5 mm位置做一個1 mm小孔，將微量進(jìn)樣器置入約5 mm，即達(dá)尾狀核位置。模型組和腹腔NGF注射組大鼠被緩慢注入50 μL自體鼠尾血；假手術(shù)組大鼠被緩慢注入50 μL無菌生理鹽水，均在15～20 min完成注射，留針5 min后退出微量進(jìn)樣器，采用骨蠟封閉鉆孔顱骨并縫合大鼠皮膚。術(shù)后大鼠清醒后采用Bederson[7]等的四級評分法對大鼠造模情況進(jìn)行評價，若神經(jīng)功能缺損癥狀≥1級則視為造模成功，剔除造模失敗大鼠，以備用大鼠隨機(jī)補(bǔ)充。

于大鼠腦出血模型建立30 min后給予NGF組大鼠腹腔注射5 μg/kg NGF[舒泰神(北京)藥業(yè)有限公司，2 毫克/瓶，國藥準(zhǔn)字S20060023]，給予假手術(shù)組、模型組大鼠腹腔注射5 μg/kg 生理鹽水。

1.3 研究方法

各組分別于術(shù)后第1、3、5天隨機(jī)選擇5只大鼠，采用過量水合氯醛進(jìn)行麻醉，迅速打開胸腔，自左心室灌注生理鹽水，直至由剪開的右心耳流出的液體變?yōu)榍辶翞橹?，之后斷頭取腦，去除小腦、腦干、嗅球和額極前部約4 mm的腦組織，將右側(cè)大腦半球中部進(jìn)針位置周圍腦組織冠狀切割成2 mm的薄片2片，其中1片用于腦組織含水量測定，另一片經(jīng)10%福爾馬林固定和梯度酒精脫水后采用石蠟包埋，連續(xù)切成2 μm切片，用于HE染色、免疫組織化學(xué)檢測等。(1)腦組織含水量檢測：采用干濕重法測定大鼠腦組織含水量，置于稱量瓶中，利用電子天平稱取濕重，于105 ℃恒溫肝臟箱內(nèi)烘至恒重，再次稱重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%；(2)HE染色及炎癥反應(yīng)觀察：選取一片2 μm切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇脫苯后采用蘇木素-伊紅(HE)染色，制備好的玻片于100×光學(xué)顯微鏡下觀察出血部位，調(diào)整至400×觀察血腫周圍腦組織病理變化和炎癥反應(yīng)情況，并與正常部位比較；(3)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測：每只大鼠隨機(jī)選擇5張切片采用TUNEL法檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒步驟進(jìn)行操作，于400×光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇6個無重疊視野進(jìn)行觀察和計數(shù)，細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒者為TUNEL陽性凋亡細(xì)胞；(4)免疫組織化學(xué)染色檢測：采用免疫組織化學(xué)法檢測血腫周圍腦組織IL-6和SOCS-3表達(dá)情況，實驗操作步驟嚴(yán)格按照S-P免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行。采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，已知抗體陽性標(biāo)本作為陽性對照。IL-6表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，SOCS-3表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，相應(yīng)位置表現(xiàn)為淡黃色至棕褐色即為陽性。于400×光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇6個無重疊視野進(jìn)行觀察和計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠血腫周圍腦組織含水量比較

假手術(shù)組大鼠術(shù)后3個時間點血腫周圍腦組織含水量比較無顯著差異(P>0.05)；模型組和NGF組大鼠術(shù)后各時間點血腫周圍腦組織含水量均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，且均在術(shù)后3 d達(dá)到最高值，隨后下降，但術(shù)后5 d時模型組和NGF組大鼠血腫周圍腦組織含水量仍顯著高于術(shù)后1 d(P<0.05)；NGF組大鼠術(shù)后各時間點血腫周圍腦組織含水?dāng)?shù)量均顯著低于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠血腫周圍腦組織不同時間點含水量比較

2.2 3組大鼠血腫周圍組織炎癥反應(yīng)比較

假手術(shù)組大鼠術(shù)后針孔周圍腦組織結(jié)構(gòu)清晰且完整，細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整；神經(jīng)元排列整齊，未見水腫和炎性細(xì)胞浸潤。模型組和NGF組大鼠術(shù)后針孔周圍腦組織可見炎性細(xì)胞浸潤，腦細(xì)胞水腫和空泡樣改變，細(xì)胞核發(fā)生一定程度固縮；細(xì)胞和血管周圍間隙變寬，染色質(zhì)密度增加，伊紅染色增深。術(shù)后第1天時模型組和NGF組大鼠血腫周圍表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞增加，細(xì)胞水腫，神經(jīng)元細(xì)胞部分壞死；術(shù)后第3天時可見明顯細(xì)胞充血水腫，炎性細(xì)胞大量浸潤，神經(jīng)元細(xì)胞壞死，膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生增生；術(shù)后第5天時炎性細(xì)胞數(shù)量減少，水腫程度減輕。NGF各時間點腦出血周圍炎癥、水腫程度、神經(jīng)元細(xì)胞壞死程度均顯著好于模型組，見圖1～3。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖1 術(shù)后第1天各組HE染色

A為模型組；B為NGF組圖2 術(shù)后第3天各組HE染色

A為模型組；B為NGF組圖3 術(shù)后第5天各組HE染色

2.3 3組大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡比較

假手術(shù)組大鼠術(shù)后3個時間點血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL染色陽性率比較無顯著差異(P>0.05)；模型組和NGF組大鼠術(shù)后各時間點血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL染色陽性率均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，且均在術(shù)后第1天達(dá)到最高值，隨后顯著下降(P<0.05)；NGF組大鼠術(shù)后各時間點血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL染色陽性率均顯著低于模型組(P<0.05),見圖4～6、表2。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖4 術(shù)后第1天各組TUNEL染色

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖5 術(shù)后第3天各組TUNEL染色

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖6 術(shù)后第5天各組TUNEL染色

表2 3組大鼠血腫周圍腦組織不同時間點血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL染色陽性數(shù)目(個，

2.4 3組大鼠血腫周圍腦組織IL-6和SOCS-3表達(dá)情況比較

假手術(shù)組大鼠術(shù)后3個時間點血腫周圍腦組織IL-6和SOCS-3染色陽性數(shù)目比較無顯著差異(P>0.05)；模型組和NGF組大鼠術(shù)后各時間點血腫周圍腦組織IL-6和SOCS-3染色陽性數(shù)目均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，且均在術(shù)后第3天達(dá)到最高值，術(shù)后第5天均顯著降低(P<0.05)，與術(shù)后第1天比較無顯著差異(P>0.05)。NGF組大鼠術(shù)后各時間點血腫周圍腦組織IL-6染色陽性數(shù)目顯著低于模型組，但SOCS-3染色陽性數(shù)目顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7～12和表3～4。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖7 術(shù)后第1天各組IL-6染色

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖8 術(shù)后第3天各組IL-6染色

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖9 術(shù)后第5天各組IL-6染色

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖10 術(shù)后第1 天各組SOCS-3染色

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖11 術(shù)后第3天各組SOCS-3染色

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NGF組圖12 術(shù)后第5天各組SOCS-3染色

表3 3組大鼠血腫周圍腦組織不同時間點血腫周圍腦組織IL-6染色陽性數(shù)目(個，

表4 3組大鼠血腫周圍腦組織不同時間點血腫周圍腦組織SOCS-3染色陽性數(shù)目(個，

3 討 論

腦出血后可通過多種途徑引發(fā)腦組織損傷和炎性反應(yīng)，進(jìn)而造成腦水腫和神經(jīng)元凋亡，影響患者神經(jīng)功能。有研究表明腦出血后血腫周圍腦組織炎癥反應(yīng)程度遠(yuǎn)高于非出血性腦損傷，引起的腦水腫更加嚴(yán)重[8]。本研究結(jié)果顯示模型組和NGF組大鼠術(shù)后第1～5天血腫周圍腦組織含水量均顯著高于假手術(shù)組，術(shù)后第3天達(dá)到峰值，之后降低。與目前報道的腦出血后第2～3天神經(jīng)功能障礙最嚴(yán)重，之后逐漸恢復(fù)相一致[9]，也提示腦水腫程度能夠直接反應(yīng)神經(jīng)功能損害。另外NGF組大鼠各時間點腦組織含水量顯著低于模型組，也提示NGF能夠降低腦出血大鼠腦組織含水量。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)NGF組和模型組大鼠血腫周圍腦組織出現(xiàn)炎癥、水腫、神經(jīng)元細(xì)胞壞死等病理改變，而NGF組各項病理改變程度均低于模型組，與周仁蘭等[10]研究結(jié)果一致。這與NGF能夠抑制Ca2+超載，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，并能夠為神經(jīng)元修復(fù)提供營養(yǎng)因子，促進(jìn)軸突和神經(jīng)纖維再生有關(guān)。

高水平IL-6能夠通過以下途徑介導(dǎo)腦損傷[11-12]：(1)破壞血腦屏障，提高其通透性，加重腦水腫程度，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡；(2)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(ICAM-1)表達(dá)，增加細(xì)胞間粘附性，造成細(xì)胞聚集，阻塞微血管；(3)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞活性，加重炎癥反應(yīng)；(4)增加氧自由基產(chǎn)生和釋放，加重腦細(xì)胞損傷；(5)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，形成細(xì)胞毒性損傷。JAK/STAT是IL-6的重要調(diào)節(jié)通路，受SOCS家族的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，其中以SOCS-3研究最多。本研究結(jié)果顯示模型組和NGF組大鼠血腫周圍腦組織IL-6和SOCS-3染色陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，NGF組大鼠術(shù)后各時間點血腫周圍腦組織神IL-6染色陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著低于模型組，但SOCS-3染色陽性細(xì)胞數(shù)目顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，提示NGF能夠通過上調(diào)SOCS-3表達(dá)來下調(diào)IL-6表達(dá)，繼而起到改善腦水腫作用。

本研究結(jié)果還顯示，NGF組和模型組大鼠各時間點血腫周圍組織神經(jīng)元凋亡數(shù)目顯著高于假手術(shù)組，且均在術(shù)后第1天達(dá)到最高值，隨后顯著下降(P<0.05)。與Karwacki Z等[13]研究結(jié)果相符。而NGF組大鼠術(shù)后各時間點血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL染色陽性率均顯著低于模型組(P<0.05)，與NGF能夠調(diào)控SOCS-3和IL-6表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)和腦水腫有關(guān)。

綜上所述，NGF可能通過上調(diào)SOCS-3表達(dá)，下調(diào)IL-6表達(dá)改善腦出血后腦組織炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)元凋亡等途徑發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用。