葉天寶，張振宇，王伯仁，王大昊

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

骨肉瘤是最常見的發(fā)生于青少年的原發(fā)性惡性腫瘤，排在所有惡性腫瘤發(fā)生率的第8位，約占骨惡性腫瘤的20%。隨著醫(yī)療水平和治療手段的不斷進(jìn)步，骨肉瘤患者的5年生存率已經(jīng)從20世紀(jì)60年代的不到20%提升到20世紀(jì)80年代的中期的近70%。然而，近20年來，骨肉瘤患者的治療效果并沒有明顯提升，且合并遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率仍較低[1-2]。

現(xiàn)階段，骨肉瘤的治療是以新輔助化療為主的綜合治療，化學(xué)治療是主要手段之一。雖然化療使患者的生存率有了明顯的提高，但耐藥性的產(chǎn)生成為影響化療藥物效果的主要障礙[3]?？朔侨饬鏊幬锬退幨悄壳爸攸c(diǎn)研究的領(lǐng)域，腫瘤的耐藥是多種機(jī)制參與的非常復(fù)雜的過程，其中，多藥耐藥(multiple drug resistant，MDR)的產(chǎn)生，是目前臨床上骨肉瘤化學(xué)治療的主要障礙之一[4]。

雖然多藥耐藥-1基因(MDR-1)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚未完全了解，但據(jù)研究顯示，大量的轉(zhuǎn)錄因子參與其中，如Ras、Sp1、P53、NF-κB等[5-8]。多種耐藥的產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，但目前研究較多且有大量證據(jù)支持的仍為能量依賴型將化療藥物泵出細(xì)胞的外排系統(tǒng)，如P-糖蛋白[9]。P-糖蛋白(permeability glycoprotein，P-gp)由MDR-1基因編碼，是一個分子量為170 kDa的跨膜糖蛋白，既能與ATP結(jié)合，也能與藥物結(jié)合，具有能量依賴型“藥泵”功能[10-11]。NF-κB是廣泛存在于體內(nèi)細(xì)胞中的重要核轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)有密切關(guān)系。

多柔比星是臨床上常用的化療藥物之一，屬于蒽環(huán)類，抗瘤譜較廣。本研究以多柔比星作用于人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞，觀察多柔比星促進(jìn)人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。MTS由美國Promega公司生產(chǎn)，DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清由Thermo公司生產(chǎn)，Annexin V ：FITC Apoptosis Detection Kit I由BD公司生產(chǎn)，二甲基亞楓(DMSO)、胰酶、Western blot相關(guān)試劑購自碧云天(北京)生物技術(shù)有限公司，兔抗人NF-κB抗體由英國Abcam公司生產(chǎn)，鼠抗人P-gp抗體由美國Millipore公司生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

(1)人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基，5% CO2的37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)基底板面積的75%～80%左右棄去培養(yǎng)液；(2)加入適量PBS液漂洗1次，棄去PBS液；(3)用0.25%胰酶消化，倒置顯微鏡下見細(xì)胞間隙增大、胞質(zhì)回縮時終止消化，然后分瓶再培養(yǎng)；(4)待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后用于實驗或每2～3 d換液傳代，見圖1。

40× 200×圖1 細(xì)胞培養(yǎng)圖片

1.3 MTS法測定細(xì)胞增殖活性

(1)于96孔板培養(yǎng)板中每孔加入100 μL的1×105/L人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞，每排加6孔，留2孔只加培養(yǎng)液做調(diào)零孔，細(xì)胞周圍的孔由PBS填充，避免“周圍效應(yīng)”(即水分蒸發(fā)造成的濃度改變)；(2)各孔依次加入0、1、5、10和100 μg/mL DOX，37 ℃分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTS 10 μL；(3)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=A實驗組-空白組/A對照組-空白組×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡

(1)于6孔板培養(yǎng)板中每孔加入2 mL 5×105/L人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞，細(xì)胞分為5組，分別為不含藥物的正常對照組和分別加入不同濃度(1、5、10、100 μg/mL)的DOX組；(2)分別培養(yǎng)24、48、72 h后，用0.25%胰酶常規(guī)消化細(xì)胞，收集至流式管，1200 rpm，離心5 min，棄上液；(3)每管加入適量PBS液，重懸細(xì)胞，輕輕吹打，避免氣泡，1200 rpm，離心5 min，重復(fù)2次； (4)配制Binding buffer為1×Binding buffer，加入100 μL 1×Binding buffer重懸細(xì)胞；(5)加入5 μL Fluorochrome-conjugated Annexin V；(6)室溫孵育10～15 min；(7)加入5 μL Propidium Iodide，室溫孵育5 min后即可上流式細(xì)胞儀檢測，一般4 h內(nèi)上機(jī)均可，可2～8 ℃避光保存。

1.5 Western blot法檢測目的基因的蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞培養(yǎng)同前，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞得胞質(zhì)蛋白，用BCA法測定其濃度。取30 μg蛋白上樣到SDS-聚丙烯酞胺凝膠(分離膠濃度為10%、濃縮膠濃度為5%)，電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫5%脫脂牛奶搖床2 h以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，分別用NF-κB抗體1∶3000，P-gp抗體1∶500，4 ℃搖床過夜，設(shè)GAPDH為內(nèi)參，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵化2 h，TBST洗膜3次，將高敏ECL發(fā)光液A、B液按1∶1比例混勻后完全浸濕PVDF膜，使用MF-ChemiBIS凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 DOX對骨肉瘤U2-OS細(xì)胞增殖的影響

各組骨肉瘤細(xì)胞的吸光度值(A值)顯示，用1、5、10和100 μg/mL DOX作用骨肉瘤U2-OS細(xì)胞24 h后，各藥物組吸光度值分別為(1.583±0.007)、(1.423±0.035)、(1.370±0.021)、(1.083±0.255)，對照組為(1.611±0.016)，各藥物組與對照組相比及各藥物組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；作用48 h后，各藥物組吸光度值分別為(1.521±0.027)、(1.362±0.022)、(1.146±0.030)、(0.985±0.015)，對照組為(1.609±0.028)，各藥物組與對照組相比及各藥物組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；作用72 h后，各藥物組吸光度值分別為(1.248±0.057)、(1.108±0.040)、(0.941±0.033)、(0.544±0.028)，對照組為(1.476±0.066)，各藥物組與對照組相比及各藥物組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 多柔比星對骨肉瘤細(xì)胞生長的抑制曲線

2.2 DOX對骨肉瘤U2-OS細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，用1、5、10和100 μg/mL DOX作用骨肉瘤U2-OS細(xì)胞24 h后，各藥物組凋亡率分別為(14.155±0.488)%、(24.750±0.636)%、(33.650±0.919)%、(58.150±2.616)%，對照組為(3.645±0.785)%，各藥物組與對照組相比及各藥物組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；作用48 h后，各藥物組凋亡率分別為(15.575±1.252)%、(37.600±1.839)%、(42.590±3.974)%、(65.150±0.495)%、對照組為(3.585±0.007)%，各藥物組與對照組相比及各藥物組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；作用72 h后，各藥物組凋亡率分別為(27.950±2.475)%、(45.650±0.495)%、(56.050±1.060)%、(75.250±0.919)%，對照組為(6.230±0.226)%，各藥物組與對照組相比及各藥物組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 不同濃度多柔比星作用于U2-OS細(xì)胞24、48、72 h后凋亡率變化

2.3 DOX對骨肉瘤U2-OS細(xì)胞的NF-κB和P-gp 蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，用1、5、10和100 ug/mL不同濃度的DOX作用U2-OS細(xì)胞24 h后，NF-κB的蛋白表達(dá)水平各組分別為(1.9033±0.1697)、(2.0595± 0.1124)、(2.8318±0.4279)、(3.1559±0.5710)均較對照組(0.3068±0.0601)明顯升高，隨DOX濃度增加而升高，NF-κB的表達(dá)量與DOX的作用呈劑量正相關(guān)(P<0.05)。P-gp的蛋白表達(dá)水平與對照組(0.4238±0.0804)相比，各組間呈升高趨勢，1 μg/mL組(0.2953±0.1108)、5 μg/mL組(0.4660±0.0849)、10 μg/mL組(0.6062±0.0462)及100 μg/mL(0.7893±0.1113)P-gp蛋白的表達(dá)水平隨DOX濃度增而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4～5。

圖4 用0、1、5、10和100 μg/mL DOX作用骨肉瘤U2-OS細(xì)胞24 h后NF-κB蛋白表達(dá)

圖5 用0、1、5、10和100 μg/mL DOX作用骨肉瘤U2-OS細(xì)胞24 h后P-gp蛋白表達(dá)

3 討 論

骨肉瘤是好發(fā)于青少年最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，惡性程度高，遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移發(fā)生較早，預(yù)后差[12]。骨肉瘤的治療開展以新輔助化療為主的綜合性治療，雖然多柔比星等化療藥物對骨肉瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺滅能力，但長期應(yīng)用后的耐藥及毒副反應(yīng)仍然是影響治療效果的主要障礙[13]。多藥耐藥(MDR)的形成是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，每一種機(jī)制都有十分復(fù)雜而精細(xì)的過程，研究表明，腫瘤細(xì)胞對多種化療藥物如紫杉醇、蒽環(huán)類的抗性與過度表達(dá)的P-gp有關(guān)系。而P-gp就是MDR轉(zhuǎn)運(yùn)體中三磷酸腺苷結(jié)合盒型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(ABC)的一員[14]。研究腫瘤細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，參與P-gp導(dǎo)多藥耐藥信號傳導(dǎo)的通路主要有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、環(huán)核苷酸依賴性蛋白激酶(cAMP /PKA)信號通路、NF-κB信號通路等[15-16]。其中，研究較為廣泛的是NF-κB信號通路。Yague[17]等人使用多種化療藥物(包括多柔比星)處理化療敏感白血病K562細(xì)胞72 h后，同樣發(fā)現(xiàn)MDR1基因表達(dá)明顯升高。有研究表明，在肝癌耐藥細(xì)胞中，可以通過下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)P-gp蛋白的高表達(dá)[18]。研究顯示，在人膀胱癌T24/J82耐藥細(xì)胞株中，MDR1基因高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)可以通過激活NF-κB信號通路增加MDR1基因的表達(dá)，同時也能增強(qiáng)T24/J82耐藥細(xì)胞對化療藥物順鉑的耐藥性[19]。

本實驗用不同濃度的DOX作用于人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞，MTS結(jié)果顯示DOX能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長，且各藥物濃度組細(xì)胞生長明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，隨各組DOX濃度和時間增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上兩項結(jié)果表明，多柔比星作為經(jīng)典抗腫瘤藥物，在體外多柔比星可以明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其產(chǎn)生凋亡，其抑制率和凋亡率隨藥物濃度呈時間-劑量依賴性；NF-κB是一類特別重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其廣泛存在于多種細(xì)胞中，能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，一項研究表明，核因子κB及P-gp蛋白過表達(dá)與骨肉瘤的化療耐藥有關(guān)；P-gp蛋白是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中發(fā)現(xiàn)最早的一個蛋白，也是目前研究最廣泛和最深入的一個蛋白，P-gp為廣譜藥物的外排泵，在腫瘤化療過程中，可以促進(jìn)化療藥物的外排，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療抵抗力，進(jìn)而導(dǎo)致化療耐藥的發(fā)生；相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，P-gp高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，P-gp高表達(dá)骨肉瘤患者的腫瘤轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率均較P-gp低表達(dá)骨肉瘤患者明顯增高[20]；本實驗用不同濃度DOX作用于人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞24 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，各個給藥組核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的蛋白表達(dá)量隨DOX濃度增加而增加，同時P-gp蛋白表達(dá)量也隨DOX濃度增加而增加，可以看出其表達(dá)量與藥物的作用濃度之間呈現(xiàn)正相關(guān)。因此，本研究表明，多柔比星可能通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)從而介導(dǎo)骨肉瘤U2-OS細(xì)胞多藥耐藥P-gp蛋白表達(dá)升高。

多藥耐藥形成的機(jī)制十分復(fù)雜，骨肉瘤化學(xué)治療中，如何提高化療藥物敏感性，減少耐藥的發(fā)生，還需要深入研究。繼續(xù)研究及探討骨肉瘤耐藥細(xì)胞株中相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子及多藥耐藥蛋白的關(guān)系，用不同方法(如質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等)繼續(xù)探討研究NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在骨肉瘤多藥耐藥(MDR)的發(fā)生、發(fā)展中的作用，尋找有效的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子抑制劑，降低或逆轉(zhuǎn)多藥耐藥蛋白的表達(dá)，將為減少骨肉瘤耐藥的發(fā)生以及提高骨肉瘤患者療效和生存率有重要意義。