曹桂紅,王興寧,劉 璐,黃春青,許 波*

(1.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所,貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴陽(yáng)海關(guān)綜合技術(shù)中心,貴州 貴陽(yáng) 550081)

0 引言

替格瑞洛(Ticagrelor)是一種新型、選擇性小分子抗凝血的非前體藥物[1]，為可逆性P2Y12受體拮抗劑[2-3]，通過與血小板上的P2Y12受體可逆結(jié)合，可迅速抑制二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集，發(fā)揮抗血小板聚集、擴(kuò)張血管作用，有效抑制動(dòng)脈粥樣化血栓的形成，其制劑替格瑞洛片用于治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)。2012年11月批準(zhǔn)上市，商品名為倍林達(dá)(Brtilita)[4]，因相比氯吡格雷具有起效快、個(gè)體差異小、出血風(fēng)險(xiǎn)降低等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛關(guān)注，目前替格瑞洛片已在全球多個(gè)國(guó)家獲批[5-7]。

替格瑞洛的合成路線復(fù)雜，通過調(diào)研收集到3家生產(chǎn)企業(yè)的合成工藝路線圖。這3條合成路線都是對(duì)3個(gè)關(guān)鍵中間體即嘧啶環(huán)、五元環(huán)和三元環(huán)進(jìn)行縮合、環(huán)合、再縮合、酸解、重結(jié)晶得到替格瑞洛。合成過程中涉及甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、異辛烷、正庚烷、二氧六環(huán)、甲苯、N,N-二異丙基乙胺、二氯甲烷、乙二醇等14種有機(jī)溶劑。當(dāng)前替格瑞洛原料藥的標(biāo)準(zhǔn)中，殘留溶劑的檢驗(yàn)方法為采用氣相色譜法分3個(gè)系統(tǒng)分別測(cè)定6種、4種和3種殘留溶劑。有研究顯示，用頂空氣相色譜法可測(cè)定替格瑞洛中的8種殘留溶劑[8]，毛細(xì)管氣相色譜法可測(cè)定替格瑞洛中溶劑殘留量[9-10]。為控制該制劑中殘留溶劑的量，本研究對(duì)替格瑞洛片中的14種殘留溶劑進(jìn)行了溶解、提取，并建立了氣相色譜法同時(shí)測(cè)定替格瑞洛片中14種殘留溶劑。

1 儀器與材料

島津2030氣相色譜儀、包括FID檢測(cè)器(日本島津公司)；毛細(xì)管柱DB-624(75 m×0.53 mm×3 μm，美國(guó)安捷倫公司)；電子天平(XS205DU，美國(guó)METTLER公司)。

溶劑：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、異辛烷、正庚烷、二氧六環(huán)、N,N-二異丙基乙胺、乙二醇、甲苯及乙醇及正丙醇(內(nèi)標(biāo))均為(色譜純，上海安譜公司)。

替格瑞洛片來源于8個(gè)廠家的60批次日常檢驗(yàn)樣品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-624毛細(xì)管柱(75 m×0.53 mm×3 μm)；進(jìn)樣口溫度：200 ℃； 檢測(cè)器溫度：250 ℃；載氣：氮?dú)?純度>99.999%)；柱流量：5 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；分流比為10∶1；程序升溫：起始溫度35 ℃，保持14 min，以60 ℃/min升溫至60 ℃，保持7 min，再以60 ℃/min升至150 ℃，保持15 min。14種殘留溶劑的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限見表1。

表1 14種殘留溶劑的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限Tab.1 Retention times，linear equations，correlation coefficient(r2)，Linearity ranges，LODs、LOQs of 14 residual solvents

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液

精密稱取1 g(精確至0.01 g)的樣品于10 mL容量瓶中，加DMF適量，密塞，振搖20 min，加0.4 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用DMF稀釋至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至15 mL聚乙烯離心管中，以8 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜供氣相色譜儀分析。

2.2.2 對(duì)照品溶液

單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備：分別精密稱取0.2 g甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、異辛烷、正庚烷、二氧六環(huán)、甲苯、N,N-二異丙基乙胺、二氯甲烷、乙二醇、正丙醇于預(yù)置有1 mL DMF的20 mL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度、搖勻，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備：分別精密量取異辛烷、正庚烷、甲苯、N,N-二異丙基乙胺單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液2 mL；甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、二氧六環(huán)、乙二醇、二氯甲烷4 mL；二氯甲烷6 mL于100 mL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，備用。

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：精密量取4 mL正丙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備：精密吸取混合對(duì)照儲(chǔ)備液1 mL于50 mL的容量瓶中，加2 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用DMF稀釋、定容至刻度，搖勻，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的制備：分別取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1 000 μL于10 mL容量瓶中，分別加入0.4 mL的內(nèi)標(biāo)溶液，用DMF稀釋至刻度，搖勻，備用。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和空白溶劑，按2.1的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中14種殘留溶劑峰、內(nèi)標(biāo)峰及溶劑的色譜峰均能達(dá)到有效分離，峰形尖銳、對(duì)稱性好(見圖1、圖2和表2)。

圖1 溶劑色譜圖Fig.1 Chromatogram of solvent

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard working solution

3.2 溶劑的選擇

本試驗(yàn)比較了常用于殘留溶劑分析的二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺2種溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14種殘留溶劑中異辛烷不溶于二甲基亞砜，而14種殘留溶劑均溶于N,N-二甲基甲酰胺，因此選擇N,N-二甲基甲酰胺作為溶劑，且溶劑中的雜質(zhì)峰與相鄰的色譜峰能達(dá)到有效分離，無干擾。

化合物保留時(shí)間(RT/min)理論塔板數(shù)(USP)分離度(USP)甲醇6.01551 448-乙醇8.49535 93517.1異丙醇10.53627 1197.5乙腈11.56343 9942.2二氯甲烷11.85741 8062.9甲基叔丁基醚13.13918 2414.4乙酸乙酯17.530123 4978.9四氫呋喃18.49275 3212.8異辛烷20.48951 8569.3正庚烷22.06377 1453.1二氧六環(huán)23.467892 6619.2甲苯24.4781 054 50914.1N,N-二異丙基乙胺25.480512 0415.9乙二醇26.5022 668 3391.5正丙醇(內(nèi)標(biāo))15.52490 92910.7

3.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

正丙醇與14種目標(biāo)物的色譜峰無干擾、有效分離，方法的回收率和精密度也符合殘留分析的要求[9]，因此選擇正丙醇作為內(nèi)標(biāo)物。

3.4 色譜柱的選擇

14種溶劑的極性差異較大，試驗(yàn)中對(duì)比了弱極性的HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)與中極性DB-624(75 m×0.53 mm×3 μm)色譜柱。結(jié)果表明，HP-5的分離度極差，且溶劑與14種目標(biāo)物不能很好的分離，14種目標(biāo)物之間也不能完全分離。因此，選擇DB-624(75 m×0.53 mm×3 μm)具有較好的分離度，溶劑與目標(biāo)物、目標(biāo)物之間均能實(shí)現(xiàn)良好分離。

3.5 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1 000 μL于10 mL容量瓶中，分別加入0.4 mL的內(nèi)標(biāo)溶液，用DMF稀釋至刻線，從低濃度向高濃度依次進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖3)。以質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，各個(gè)化合物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y為縱坐標(biāo)計(jì)算線性回歸方程，結(jié)果表明，各溶劑峰面積/內(nèi)標(biāo)，峰面積的比值線性關(guān)系良好(r2≥0.999 5)。按3倍的信噪比(3S/N)計(jì)算檢出限，10倍信噪比(10S/N)計(jì)算定量限，14種殘留溶劑的檢出限為0.7～8.8 μg/mL，定量限為1.0～20.8 μg/mL(見表1)。

圖3 乙二醇色譜圖Fig.3 Chromatogram of Ethylene glycol

3.6 回收率與精密度

選取同一批次空白樣品18份，添加3個(gè)水平2.04～ 48.85 μg/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)試6次，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)。結(jié)果表明：14種殘留溶劑的平均回收率為73.6%～122.1%，RSD為0.4%～12.2%，結(jié)果滿足《中國(guó)藥典》四部通則0861 藥品中常見的殘留溶劑及限度和通則9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則對(duì)回收率與精密度的要求[11]，見表3。

表3 14種殘留溶劑的回收率及精密度結(jié)果(n=6)Tab.3 Spiked recoveries and relative standard deviation(RSDs) of 14 PAEs in Rape oil(n=6)

4 樣品測(cè)定

按照本研究建立的方法對(duì)60批樣品的14種殘留溶劑的殘留量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果有1批樣品中檢出乙二醇，且含量低于定量限，殘留量在允許范圍內(nèi)[9]。

5 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜法快速分析替格瑞洛片中14種殘留溶劑的方法。優(yōu)化的色譜條件可同時(shí)分離測(cè)定14種殘留溶劑；方法的線性關(guān)系良好，r大于0.999 5；空白樣品的加標(biāo)回收率為73.6%～122.1%，RSD為0.4%～12.2%；定量限為1.0～20.8 μg/mL，可滿足現(xiàn)有限量法規(guī)的檢測(cè)要求。該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢(shì)，可為替格瑞洛及其制劑替格瑞洛片中14種殘留溶劑的日常監(jiān)控檢測(cè)提供實(shí)用的技術(shù)手段。