吳振村, 周艷

1張家口市婦幼保健院檢驗(yàn)科(河北張家口 075000)；2河北北方學(xué)院免疫教研室(河北張家口 075000)

乳腺癌(breast cancer，BC)是最常見(jiàn)的危害女性健康的惡性腫瘤，是全世界婦女癌癥死亡的第二大原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有160多萬(wàn)婦女被診斷患有乳腺癌，雖然乳腺癌的早期診斷和早期治療取得了顯著進(jìn)展，但每年仍有約52萬(wàn)人死于該疾病，約占所有癌癥死亡人數(shù)的25%[2]?？赡茉虬òl(fā)現(xiàn)晚、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3-5]等。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與多種基因的調(diào)控密切相關(guān)[6]。目前，乳腺癌高危人群的基因檢測(cè)和靶向基因治療正在迅速出現(xiàn)[7]，是除常規(guī)療法之外又一新的重要治療方法。近年來(lái)，采用RNA干擾技術(shù)沉默特定基因在乳腺癌治療研究中取得了良好的效果。郭智慧等[8]采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞DEK基因、管海濤等[9]利用siRNA技術(shù)沉默survivin的表達(dá)均可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)人類白細(xì)胞抗原-E(human leukocyte antigen-E，HLA-E)基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生相關(guān)[10-12]，基于前期研究，2021年1—12月本研究設(shè)計(jì)并合成了HLA-E siRNA序列，探討siRNA技術(shù)沉默人乳腺癌細(xì)胞HLA-E基因表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡及對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，為乳腺癌靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。本研究得到張家口市婦幼保健院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：KYLL-2020-001)。

1 材料與方法

1.1 材料 Vigofect轉(zhuǎn)染試劑(北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司); DMEM干粉(Gibco公司); SuperRT cDNA Synthesis Kit(北京康為世紀(jì)生物有限公司)；UltraSYBR Mixture(Low ROX) (北京康為世紀(jì)生物有限公司)；鼠抗人HLA-E單克隆抗體(ab11821，Abcam公司)；CCK-8試劑盒(碧云天)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天)；乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(本室保存)，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(DMEM-10)，5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；雌性BALB/c 裸鼠20只，4～6周齡(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì) 從ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取人HLA-E mRNA序列(GenBank:X56841.1)，利用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件，設(shè)計(jì)并篩選與預(yù)測(cè)HLA-E mRNA容易結(jié)合的siRNA序列，作為HLA-E siRNA，采用隨機(jī)打亂的方法設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA序列。

1.2.2 轉(zhuǎn)染siRNA至乳腺癌細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)分3組,空白對(duì)照組不加任何試劑;陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA;HLA-E siRNA組轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，接種于6孔板，培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)60%～80%融合度。取5 μg HLA-E siRNA序列或陰性對(duì)照siRNA序列分別與2 μL VigoFect 轉(zhuǎn)染試劑混勻于100 mL生理鹽水，室溫靜置15 min后逐滴加入培養(yǎng)細(xì)胞液中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)HLA-E mRNA水平 收集轉(zhuǎn)染48 h各組細(xì)胞，TRIZOL裂解法提取細(xì)胞總RNA，Eppendorf核酸定量測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度和純度，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。取1 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用UltraSYBR Mixture(Low ROX)進(jìn)行 Real-time PCR檢測(cè)HLA-E mRNA表達(dá)。

1.2.4 Western blot分析HLA-E 蛋白水平 收集轉(zhuǎn)染48 h各組細(xì)胞，用預(yù)冷的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按80 μg/孔上樣量進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，分離后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，鼠抗人HLA-E單抗(1∶2 000)4℃孵育過(guò)夜，PBS-T洗滌后，加入羊抗鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，PBS-T洗滌后，加入ECL底物顯色。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度為2×104個(gè)/mL，取100 μL懸液接種于96孔板內(nèi)，設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和HLA-E siRNA組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔細(xì)胞加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值(OD450)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按4×105個(gè)/mL接種于6孔板，設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和HLA-E siRNA組，轉(zhuǎn)染48 h，收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106·mL-1，Annexin V-FITC/PI(碘化丙啶)雙染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，生理鹽水稀釋至2×107·mL-1，取0.2 mL接種于裸鼠右腋皮下，待觸摸到接種部位有瘤組織形成時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和HLA-E siRNA組，每組6只，分別瘤內(nèi)注射生理鹽水、陰性對(duì)照siRNA(1 mg/kg)和HLA-E siRNA(1 mg/kg)。每隔1 d觀察記錄瘤體大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組之間比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-E siRNA的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)HLA-E mRNA序列，利用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件(http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件，篩出一條與HLA-E mRNA預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)容易結(jié)合的HLA-E siRNA，序列為：5′-CACUCAUGUUGAGACUUAAUC-3′(正義鏈)，5′-UUAAGUCUCAACAUGAGUGUU-3′(反義鏈)；陰性對(duì)照siRNA序列為：5′-UCAGUCGUATTUUGCCAGGCCGG-3′(正義鏈)，5′-GCCGUGAUCAGGUGCUCACAGC-3′ (反義鏈)。兩種siRNA序列由上海生工合成。

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞HLA-E mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，電泳圖有3條清晰帶，即是28 s、18 s和5 s，說(shuō)明提取的每組細(xì)胞總RNA完整性較好(圖1)。Real-time PCR結(jié)果顯示，HLA-E siRNA組細(xì)胞HLA-E mRNA水平(0.53±0.07)顯著低于空白對(duì)照組(1.03±0.08)和陰性對(duì)照組(0.90±0.04)(P<0.01)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組HLA-E mRNA水平?jīng)]有明顯差異。轉(zhuǎn)染課題組設(shè)計(jì)的HLA-E siRNA序列可顯著沉默乳腺癌細(xì)胞HLA-E表達(dá)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的細(xì)胞總RNA完整性

2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞HLA-E蛋白表達(dá)水平 Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染48 h后，HLA-E siRNA組未檢測(cè)到HLA-E蛋白表達(dá)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組HLA-E 表達(dá)沒(méi)有明顯差異(圖2)。轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可沉默乳腺癌細(xì)胞HLA-E蛋白表達(dá)。

圖2 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞HLA-E 蛋白表達(dá)水平

2.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率是(8.18±0.83)%，HLA-E siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為(50.84±5.60)%，顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。

2.5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA后MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(2.14±0.98)%，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(3.21±1.05)%，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(12.63±1.50)%，顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

2.6 裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況 裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，至接種30 d時(shí)，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和HLA-E siRNA組小鼠瘤組織體積分別為(423±18)mm3、(393±18)mm3、(156±9)mm3。HLA-E siRNA組小鼠瘤組織體積顯著小于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

HLA-E是非經(jīng)典的HLA-I類基因(HLA-Ib)，其多態(tài)性有限、組織分布廣泛、正常細(xì)胞表面低表達(dá)、但病理?xiàng)l件如腫瘤或自身免疫病細(xì)胞表面高表達(dá)[13]。Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織HLA-E表達(dá)顯著高于結(jié)直腸正常和腺瘤組織，且認(rèn)為HLA-E高表達(dá)促進(jìn)了早期結(jié)直腸癌的免疫逃逸；?zgül ?zdemir等[15]也發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸瘤組織非經(jīng)典HLA-G和HLA-E表達(dá)顯著高于非癌性組織，HLA-G和HLA-E表達(dá)增加可能是腫瘤免疫逃逸的一種方式， 因此HLA-G和HLA-E可能是結(jié)直腸瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)；Gooden等[16]分析卵巢癌和宮頸癌組織HLA-E表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HLA-E在這些腫瘤中高表達(dá)，HLA-E的存在可中和卵巢癌內(nèi)浸潤(rùn)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的保護(hù)作用；非小細(xì)胞肺癌的一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)[17]，HLA-E高表達(dá)阻礙了肺腺癌內(nèi)浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的有益作用，HLA-E高表達(dá)是肺腺癌總體生存期的一個(gè)獨(dú)立的負(fù)預(yù)后因素。目前HLA-E在乳腺癌組織表達(dá)的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，約27%乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織高表達(dá)HLA-E，且約21%高異型性核病變中高表達(dá)HLA-E[18-19]；de Kruijf等[20]研究認(rèn)為，瘤組織HLA-E高表達(dá)可顯著影響乳腺癌的預(yù)后，乳腺癌可通過(guò)上調(diào)或下調(diào)經(jīng)典HLA-Ia類基因和非經(jīng)典HLA-Ib類基因逃避宿主免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的清除。我們前期分析也發(fā)現(xiàn)HLA-E等位基因可能是乳腺癌的易感基因[10-11]。這一系列的研究表明，HLA-E基因參與了多種腫瘤的發(fā)展，與腫瘤逃逸相關(guān)，可能是腫瘤免疫治療潛在靶點(diǎn)。因此，我們首次選用HLA-E基因，探討抑制HLA-E基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖與凋亡的影響，以期為乳腺癌免疫治療提供新的靶點(diǎn)。

siRNA是由外源或內(nèi)源性雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞而引起的與dsRNA同源的mRNA降解，進(jìn)而高效、特異地阻斷體內(nèi)相應(yīng)基因的表達(dá)[21]。目前siRNA技術(shù)治療的主要目標(biāo)之一是癌癥。因?yàn)榘┗颉⑼蛔兊囊职┗蚝驮S多不同基因參與了腫瘤的發(fā)展，是潛在的siRNA沉默的靶目標(biāo)，通過(guò)siRNA下調(diào)突變基因或沉默不需要的基因正成為一種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的非常有吸引力的方法[21]。研究發(fā)現(xiàn)，siRNA技術(shù)同時(shí)沉默HER2基因和uPAR基因顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，可能為乳腺癌治療提供了有效的方法[22]；靶向沉默趨化因子受體CXCR4基因可顯著阻礙乳腺癌細(xì)胞的侵襲性和黏附性[23-24]；靶向p-糖蛋白的siRNA技術(shù)可下調(diào)乳腺癌細(xì)胞p-糖蛋白表達(dá)，并提高乳腺癌對(duì)化療的敏感度，顯著抑制瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[25]。

因此，我們采用siRNA技術(shù)靶向沉默乳腺癌細(xì)胞HLA-E基因表達(dá)，探討了乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。研究設(shè)計(jì)并合成了HLA-E siRNA序列，轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，發(fā)現(xiàn)可顯著沉默乳腺癌細(xì)胞HLA-E表達(dá)，且研究發(fā)現(xiàn)HLA-E siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能夠抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。因此，靶向HLA-E siRNA技術(shù)能有效抑制靶基因的表達(dá)和乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，可能是潛在乳腺癌免疫治療的新方法。

我們研究的不足之處是未能分析siRNA技術(shù)沉默HLA-E，抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)siRNA技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞HER2和uPAR表達(dá)引起了MAPK信號(hào)通路的抑制，導(dǎo)致ERK活性降低及p38/ERK活性比值升高，從而抑制了癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此后續(xù)需將siRNA靶向沉默HLA-E分子機(jī)制作為研究重點(diǎn)。

利益相關(guān)聲明：文中所有作者認(rèn)同無(wú)任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：吳振村參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫(xiě)，周艷參與了實(shí)驗(yàn)操作。