萬澤浩, 王丁悅, 蘆梓楠, 馮修來, 米日亞·買明， 依力夏提·馬木提， 呂紅博

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 1小兒心胸外科， 4超聲科(新疆烏魯木齊 830054)； 2中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲科(遼寧沈陽 110001)； 新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 3腫瘤防治研究所， 5影像中心， 6胸外科(新疆烏魯木齊 830011)

食管癌是一種常見惡性癌癥，尤其在我國北方各省發(fā)病率和病死率位于世界前列。在世界高發(fā)地域，食管癌以鱗癌為主，中晚期食管癌治療藥物很少，且沒有明確效應的靶向藥物。時至今日，一方面?zhèn)鹘y(tǒng)外科手術輔以放療、化療的治療方式更新迭代，另一方面新興的治療手段，如生物治療、光動力治療等不斷興起，但以總體生存率的結局評判，大多數(shù)實體惡性腫瘤的治療效果不盡如人意[1]。隨著對原癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物的現(xiàn)代分子生物學的深入研究，新分子靶向藥物已經(jīng)成為了中晚期食管癌患者的曙光。一種是腫瘤血管內皮生長因子抑制劑，可以抑制血管的生成[2-3]；另一種是誘導腫瘤細胞凋亡劑促進腫瘤細胞凋亡，此類藥物常影響在食管癌[4]、白血病[5]、結腸癌[6]、乳腺癌[7]、宮頸癌[8]等都有連續(xù)高表達的核因子-κB(NF-κB)從而干擾相關通路。番茄堿是從番茄葉莖中提取的一種糖苷類生物堿[9]，具有抑制血管增生和抗癌的效果[10-12]。2019年6月至2020年10月，本實驗觀察番茄堿對食管癌Eca-109細胞增殖及凋亡過程的影響，探究番茄堿抗腫瘤機制，并以期指導新的食管癌臨床治療思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 經(jīng)過實驗室檢測無支原體、衣原體和其他微生物感染購自武漢博士德公司的食管癌Eca-109細胞。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學倫理委員會審核，給予免除涉及人的生物醫(yī)學倫理審查。

1.1.2 主要實驗試劑 番茄堿購自同田生物公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自 Hyclone公司； CCK-8試劑盒購自Dojindo公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒購自 BD公司;BCA定量試劑盒、蛋白質提取盒購自南京凱基公司(中國)；NF-κBp65、血管內皮生長因子(VEGF)、GAPDH購自CST公司；蛋白質Marker購自Life公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺、全波長酶標儀購自美國Thermo公司。流式細胞儀購自美國BD公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人食管癌Eca-109放進含10%胎牛血清的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿平放在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。經(jīng)過培養(yǎng)3 d后，將培養(yǎng)皿放置于倒置鏡下觀察，選取細胞密度達到90%左右的培養(yǎng)皿，用PBS緩沖液沖洗3次，再用胰酶-EDTA(含酚紅)消化傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 將對數(shù)生長期的食管癌Eca-109加入配制番茄堿濃度1、2、3、4、5、6、7、8、9 μmol/L的培養(yǎng)液，以1.5×105/孔在96孔板上接種細胞，將PBS處理組作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)細胞24、48 h后，將預先配制好的CCK-8混合液加入培養(yǎng)孔中，置于恒溫培養(yǎng)箱中1 h。在450 nm處用酶標儀檢測實驗組的吸光度A450值，重復檢測3次。細胞增殖抑制率(PE)=[(對照PBS孔A450-實驗孔A450)/(對照PBS孔A450-空白孔A450)]× 100%。

1.2.3 采用流式細胞術測細胞凋亡率 配制番茄堿濃度0、1.5、3、6 μmol/L含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，以0 μmol/L濃度為對照組。取對數(shù)生長期的細胞在4孔板上于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中處理1 d后用冷緩沖液沖洗細胞，消化并離心收集細胞在管中。向管中加入300 μL 1×Binding Buffer和5 μL異硫氰酸熒光素(FITC)，放于室溫下陰暗處15 min。上機檢測前5 min，每支細胞中再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液并補充200 μL 1×Binding Buffer。檢測食管癌Eca-109細胞早期、晚期和總體凋亡率，重復檢測3次，利用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 采用Western Blot法測細胞中NF-κB p65、VEGF蛋白表達 提取上述1.2.3各組細胞的相關蛋白，加入含苯甲基磺酰氟的裂解液，低溫離心半小時，留取上清液體，用BCA測定NF-κB p65、VEGF蛋白濃度。配置凝膠，恒壓電泳2 h后選用PVDF進行轉膜，轉膜電流設定為300 mA。轉膜完畢，立即漂洗，封閉過夜。取出膜加入一抗，放置于搖床上搖動孵育1 h，加入洗滌液，漂洗3次后加入二抗，顯色后使用image J分析灰度值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 CCK-8法實驗結果表明，1、2、3、4、5、6、7、8、9 μmol/L濃度番茄堿培養(yǎng)液處理食管癌細胞24、48 h后，增殖抑制率隨濃度增加而顯著增加(F=991.597，P<0.001)，呈劑量依賴性，當番茄堿濃度>6 μmol/L時，Eca-109的增殖抑制率達到90%，幾乎不存活，而不同時間組間的差異無統(tǒng)計學意義(F=0.22，P>0.05)，之后實驗濃度控制在6 μmol/L，否則大于此濃度細胞幾乎不能存活。見圖1。

圖1 不同濃度番茄堿中食管癌Eca-109細胞增殖抑制率的變化

2.2 各組食管癌細胞的凋亡率比較 不同濃度番茄堿處理食管癌Eca-109細胞24 h后，3 μmol/L番茄堿組和6 μmol/L番茄堿組的細胞平均早期凋亡率、晚期凋亡率和總體凋亡率增加，與對照組(0 μmol/L番茄堿)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而1.5 μmol/L番茄堿組與對照組(0 μmol/L番茄堿)細胞相比，凋亡率差異小，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、表1。

注：A：對照組(0 μmol/L番茄堿)；B：1.5 μmol/L番茄堿；C：3 μmol/L番茄堿；D：6 μmol/L番茄堿

表1 番茄堿對食管癌細胞凋亡的影響

2.3 各組細胞NF-κB p65與VEGF蛋白表達比較 與對照組(0 μmol /L番茄堿)對比，3、6 μmol/L番茄堿組中的NF-κB p65蛋白表達量[(0.46±0.022)、(0.17±0.035)]與VEGF蛋白表達量[(0.35±0.02)、(0.07±0.00)]都顯著下調(P<0.001)；1.5 μmol/L番茄堿組與對照組(0 μmol/L番茄堿)相比，NF-κB p65與VEGF蛋白表達量[(0.95±0.040)、(0.95±0.058)]無顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3～4。

圖3 Western blot檢測NF-κB p65和VEGF蛋白表達

注：*與對照組比較P<0.001

3 討論

中藥在惡性腫瘤的預防和診斷中有著獨特的優(yōu)勢，其生物堿類有效成分廣泛應用于對抗惡性腫瘤[13-14]。番茄堿的天然高效藥理效力，不但能抗菌[15]、降脂[16]、增強免疫力[17]、抗炎[18]，而且對多種實體瘤還可發(fā)揮抗腫瘤的作用[19-20]，但目前番茄堿對食管癌影響的研究報道極少。Yan等[21]研究表明番茄堿通過抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)的表達來抑制肺癌A549細胞的侵襲；番茄堿亦能夠對人非小細胞肺癌細胞NCI-H460產(chǎn)生顯著抑制[22]。本實驗研究表明，經(jīng)過番茄堿處理的食管癌Eca-109細胞，增殖抑制率及凋亡率明顯增加，藥物體外作用研究結果顯示：>1 μmol/L的番茄堿作用食管癌Eca-109細胞24 h即可對腫瘤細胞的存活和生長狀態(tài)產(chǎn)生影響，當番茄堿濃度>5 μmol/L時，Eca-109細胞基本不能存活，這提示番茄堿具有高效抗食管癌細胞的作用。本研究的CCK-8實驗和流式細胞術也顯示：在一定范圍內，隨著番茄堿濃度增加，其對Eca-109細胞增殖抑制和促凋亡能力相應增加。

NF-κB活化使一氧化氮合酶(NOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、白細胞介素-6(IL-6)等炎癥相關因子上調，使炎癥反應慢性低表達，有利于腫瘤發(fā)展、浸潤及轉移[23-24]。通過誘導腫瘤細胞凋亡藥物，不但可以抑制激酶復合物，使NF-κB不能轉位進細胞核與相應基因結合[25]，并且還可以阻斷該通路與DNA結合后對腫瘤細胞提供的保護，使腫瘤細胞不能維持增殖性的特征[25-26]。血管內皮生長因子在體內經(jīng)刺激已有血管和改變微血管通透度使其增生。VEGF與血管內皮生長因子受體結合，由激酶催化使自身磷酸化(autophosphorylation)，激活有絲分裂原，活化相關蛋白激酶(MAPK)，誘導血管內皮增生從而使為腫瘤增殖、生長、侵襲提供充足血管供應[27-28]。NF-κB使炎癥持續(xù)低表達持續(xù)和腫瘤細胞的大量增殖不斷加重了腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀態(tài),在食管癌發(fā)展早期，轉錄因子的表達主要由基因突變引起，而在進展期，食管癌發(fā)生、發(fā)展的相關通路進一步活化與腫瘤微環(huán)境的不斷失控導致惡性循環(huán)，兩者共同加劇腫瘤惡性增殖[29]。因此，抑制腫瘤細胞中NF-κB的活性并且抑制VEGF因子生成是抗腫瘤治療的主要思路之一。本研究的結果顯示，番茄堿處理后的Eca-109細胞的NF-κB p65、VEGF蛋白表達降低，說明番茄堿對NF-κB、VEGF有抑制作用。還有文獻表明番茄堿促凋亡作用還可通過抑制腫瘤壞死因子TNF-α誘導的NF-κB依賴的促生存蛋白實現(xiàn)，這也有可能是番茄堿抗癌的機制之一[30]。

綜上所述，本研究闡明了番茄堿能夠抑制食管癌Eca-109細胞的增殖，促進腫瘤細胞的早期凋亡和晚期凋亡，抑制Eca-109細胞中NF-κB p65、VEGF蛋白的表達，減少相關通路對腫瘤細胞保護機制和血管生成，從而影響食管癌的發(fā)生、發(fā)展。實驗結果可為番茄堿對人食管癌藥理作用提供基礎研究，但其作用機制及作用靶點還有待進一步深入研究。

利益相關聲明：本文所有作者均聲明不存在相關利益沖突。

作者貢獻說明：萬澤浩負責實驗總體設計、具體實施和論文的起草、撰寫；王丁悅負責實驗部分的設計、數(shù)據(jù)分析和論文的修改；蘆梓楠、馮修來對實驗設計給予修改和協(xié)助實驗進行；米日亞·買明負責論文的圖表圖表的制作和標注；依力夏提·馬木提負責參考文獻的檢索、總結；呂紅博對論文提出了建設性的意見。