高建， 金亦， 林潔， 林圣， 段山△

1南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院婦幼醫(yī)學研究所實驗室(廣東深圳 518040)； 2中山大學附屬第三醫(yī)院病理科(廣東廣州 510630)； 3深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究和數據管理中心分子醫(yī)學實驗室(廣東深圳 518028)

乳腺癌(breast neoplasms)是威脅全球女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，也是導致女性死亡的主要惡性腫瘤之一[1]。有數據表明，全球新確診的每100例乳腺癌患者中，有12例來自中國，新發(fā)病例增長的速度是世界平均水平的2倍；另外，中國乳腺癌的平均診斷年齡為45～55歲，平均發(fā)病年齡亦比西方國家早10～15年[2-3]。由于乳腺癌是一種高度異質性疾病，具有獨特且復雜的組織病理學模式和臨床行為，盡管有很多的研究成果，但其發(fā)生機制仍不完全清楚。非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)是人類基因轉錄組的主要組成部分，在細胞過程中發(fā)揮著重要作用，且與許多病理狀況特別是癌癥有關[4-5]。ncRNA的亞類包括microRNA(miRNA)和多種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，如lincRNA、反義RNA、假基因和環(huán)狀RNA等；miRNA長約22個核苷酸，通過與靶標轉錄物的特定位點結合而執(zhí)行轉錄后調控作用，從而導致轉錄物降解或翻譯抑制[6-7]。lncRNA為大于200個核苷酸的轉錄物，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，但不翻譯成蛋白質，在哺乳動物基因組中的數量最多[8]。競爭性內源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)的機制表明，lncRNA可以通過競爭性結合靶mRNA上的miRNA反應元件(microRNA response elements, MRE)來抑制其功能，從而充當天然miRNA的誘餌來調節(jié)基因表達；這些相互作用通常是相互關聯的，任何網絡組件的異常表達都可能破壞復雜的調節(jié)通路，最終導致癌癥的發(fā)展和進展[9-11]。已有研究表明，ceRNA機制在乳腺癌中的作用是多樣的。Chi等[12]發(fā)現lncRNA SNHG5可削弱miR-154-5p對靶基因PCNA的抑制作用，進一步增強了乳腺癌細胞的增殖；Yang等[13]的研究結果表明，miR-204能夠與參與乳腺癌上皮細胞-間充質轉化的Sox4結合，而雌激素受體陰性患者體內誘導的lncRNA ARNILA可作為miR-204的ceRNA來增強Sox4的表達，進而參與了乳腺癌的侵襲、轉移和上皮細胞-間充質轉化過程。Dong等[14]發(fā)現lncRNA TINCR在耐曲妥珠單抗乳腺癌患者中高表達，它可作為miR-125b調節(jié)HER2表達的“分子海綿”，敲低TINCR后，miR-125b表達增加，HER2表達降低，反之亦然，表明TINCR可能是預測和治療HER2陽性乳腺癌的潛在靶點。為此，我們采用人類全轉錄組基因表達譜芯片和miRNA芯片來篩選異常表達的lncRNA、miRNA和mRNA，進而構建乳腺浸潤性導管癌的特異性ceRNA相互作用網絡，進而為深入了解該病的發(fā)病機制提供新的研究思路。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集2016年3月至2018年3月在中山大學附屬第三醫(yī)院就診，行手術切除且經病理確診的乳腺浸潤性導管癌組織標本68例，所選乳腺癌患者全部為女性，中位年齡50.5歲，年齡范圍24～81歲；癌組織的分子分型標準參考圣加侖國際專家共識[13]和中國抗癌協會乳腺癌診療指南和規(guī)范(2013版)。

入組標準：(1)所有病例均由兩名副主任醫(yī)師及以上級別的醫(yī)師核實確認；(2)乳腺癌病理學分型及組織學分級參照乳腺腫瘤世界衛(wèi)生組織分類(2012版)進行，所有標本均為乳腺浸潤性導管癌(Ⅰ級～Ⅲ級)；(3)術前均未行放療和化療；(4)獲得患者及家屬的知情同意。

排除標準：(1)確診為非乳腺浸潤性導管癌患者；(2)術前已進行乳腺癌相關治療的患者；(3)相關資料不完整者；(4)合并有其他部位惡性腫瘤或其他嚴重疾病的患者。

同時收集同期乳腺良性組織標本14例。標本離體30分鐘內置超低溫冰箱保存。該研究已獲得深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心倫理委員會批準(批號：2019-004)。

1.2 主要試劑和儀器 GeneChipTMHuman Transcriptome Assay 2.0、GeneChipTMWT PLUS Reagent Kit、GeneChipTMHybridization, Wash, and Stain Kit、GeneChipTMmiRNA4.0 Aaary、FlashTagTMBiotin HSR RNA Labeling Kit以及基因芯片雜交、洗滌和掃描系統均購自美國Thermo Fisher公司；AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit和IPA(Ingenuity Pathway Analysis)應用軟件購自德國Qiagen公司。

1.3 芯片操作和差異表達分析 組織總RNA的提取根據AllPrep DNA/RNA Mini Kit說明書操作。對于HTA2.0芯片，采用WT PLUS Reagent Kit對總RNA依次反轉錄合成cDNA、體外轉錄合成cRNA、生物素標記和cRNA片段化后，與HTA2.0芯片進行雜交；對于miRNA4.0芯片，采用Biotin HSR RNA Labeling Kit對總RNA中的miRNA進行加尾和生物素標記后，與miRNA 4.0芯片進行雜交。雜交后的芯片經洗滌工作站洗滌、染色后，置于芯片掃描儀掃描，采用配套軟件TAC4.0對芯片質量和數據進行檢測和分析，當同時滿足ANOVAP<0.05且|Fold Change (linear)|>2時認為RNA分子存在差異表達。

1.4 數據預處理和ceRNA調控網絡的構建 從Affymetrix官網獲得HTA-2.0芯片的注釋文件，找到對應的基因組位置信息，然后在NONCODE數據庫中搜索對應基因組位置的lncRNA轉錄本作為探針對應的轉錄本，如果一個探針對應多個轉錄本，則選擇最長的轉錄本。利用R軟件中的“DCRNATools”包[14]構建ceRNA網絡，該包中整合了SpongeScan、StarBase v.2.0、mirTarBase以及 miRcode四個數據庫中miRNA與lncRNA、mRNA的互作關系，其中StarBase v.2.0數據庫具有更多和更全面的lncRNA-miRNA和mRNA-miRNA的關系對。ceRNA網絡構建標準如下：(1)lncRNA與mRNA表達呈正相關，判斷標準為相關系數>0.3和P<0.05；(2)lncRNA和mRNA具有與某個miRNA結合的相同MRE；(3)從構建好的ceRNA網絡中篩選受到同一個miRNA調控的mRNA和lncRNA，作為特異性ceRNA的子網絡，用Cytoscape軟件進行可視化。

1.5 利用IPA軟件分析失調表達mRNA的生物學功能 IPA是一個基于云計算的一體化的商業(yè)應用軟件，其所有解決方案都依賴Ingenuity Knowledge Base，它是一個由專家編譯的生物學相互作用以及功能注釋的知識庫，來源于蛋白、基因、復合物、細胞、組織、藥物以及疾病間獨立的建模關系，還包括人工閱讀提取的幾百萬條公開發(fā)表的科研成果和報告。本文利用該軟件來分析上調和下調表達mRNA所參與的經典通路、生物學功能以及疾病關聯情況。

2 結果

2.1 受試者臨床資料 本研究所收集到的68例女性乳腺浸潤性導管癌樣本中，涵蓋了乳腺癌常見的分子分型，典型的免疫組織化學染色結果見圖1，其中Luminal A型有17例(圖1-A)、Luminal B型有32例(圖1-B)、HER2過表達型有9例(圖1-C)和三陰性乳腺癌有10例(圖1-D)。組織學分級Ⅰ級有24例，Ⅱ級有25例，Ⅲ級有19例。

注：A：Luminal A型；B：Luminal B型；C：HER2過表達型；D：三陰性乳腺癌

2.2 差異表達分析 數據經過驗證和去重復處理后，乳腺浸潤性導管癌組織與乳腺良性組織相比，差異表達的mRNAs有513個，其中上調的有353個，下調的有160個(圖2-A)；差異lncRNAs有293個，其中上調的有156個，下調的有137個(圖2-B)；差異表達的miRNAs有165個，其中上調的有29個，下調的有136個(2-C)；其中差異表達最顯著的上調和下調的mRNA、lncRNA和miRNA各10個的列表見表1。

注：A為差異表達mRNAs火山圖；B為差異表達lncRNAs火山圖；C為差異表達miRNAs火山圖。藍點標記為下調的RNA分子，紅點標記為上調的RNA分子。|Fold Change (linear)|>2且P<0.05的RNA分子被認為存在差異表達。

表1 差異表達最顯著的上調和下調mRNAs、lncRNAs和miRNAs各10個列表

2.3 差異表達mRNAs的生物學功能分析 利用IPA分析預測差異表達mRNAs所參與的經典通路和已知疾病以及生物學過程，上調表達的代表性mRNAs有STAT1、TGFB3、EDN1、FN1、TLR9、SOCS和PRL等，主要參與的經典通路有樹突狀細胞成熟、先天性和適應性免疫細胞之間的通訊、同種異體排斥信號、B細胞發(fā)育和T輔助細胞分化等，其中樹突狀細胞成熟處于激活狀態(tài)；細胞學功能主要涉及腫瘤細胞運動、細胞損害、細胞遷移、侵襲和轉移、細胞生長和增殖、晚期惡性腫瘤、細胞間信號和相互作用等(圖3-A和3-C)。下調表達的代表性mRNA有STST3、SP1、RELA、ERBB2、EGF、SP1和SMARC4等，主要參與的經典通路有腫瘤微環(huán)境通路、HIF1α通路、HOTAIR調控通路、軸突導向信號和基質金屬蛋白酶抑制通路等，其中前3個通路處于抑制狀態(tài)，基質金屬蛋白酶的抑制作用處于激活狀態(tài)；細胞學功能主要涉及細胞運動、有絲分裂、細胞骨架生長、細胞周期、細胞發(fā)育、細胞生長和增殖和翻譯后修飾等(圖3-B和3-D)。

注： A為表達上調mRNAs在通路和分子過程中的相互關系；B為表達下調mRNAs在通路和分子過程中的相互關系；C為表達上調mRNAs對疾病和功能的影響； D為表達下調mRNAs對疾病和功能的影響。紅色表示激活，藍色表示抑制。

2.4 乳腺浸潤性導管癌中ceRNA網絡及特異性子網絡的構建 通過R軟件中的“GDCRNATools”包和Cytoscape軟件構建了差異表達lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網絡(圖4-A)。受到同一個miRNA調控的mRNA和lncRNA的特異性ceRNA子網絡結果表明，4個lncRNAs，即TC16001656.hg.1、TC15002548.hg.1、TC22001008.hg.1和TC22001009.hg.1，分別通過與hsa-miR-152-3p、hsa-miR-758-3p和hsa-miR-378d結合，進而調控61個mRNAs的表達(圖4-B)。

注： A為乳腺浸潤性導管癌差異表達的ceRNA網絡；B為差異表達特異性ceRNA子網絡。紅色菱形代表差異lncRNA，綠色圓形代表差異mRNA，藍色箭頭代表差異miRNA

3 討論

不同類型RNA分子之間的相互作用對轉錄組的穩(wěn)定、維持和調控至關重要[15]。在病理狀態(tài)下，很多基因的表達水平會發(fā)生顯著的改變，進而導致轉錄組的表達異常。因此，篩選和鑒定轉錄組中異常表達的RNA分子是闡明疾病分子機制的有效途徑之一[16]。近年來，全基因組表達分析已經成為一種常規(guī)的分析工具，尤其是為研究和理解關鍵基因在癌癥進展中的功能提供了一個很好的解決方案[17-18]。在本研究中，采用人類全轉錄組基因表達芯片和miRNA芯片來檢測乳腺浸潤性導管癌中表達異常的RNA分子，不但可以一次性檢測所有已知基因(包括編碼基因和非編碼基因)水平的表達譜，而且可以準確分析幾乎所有已知的轉錄本異構體，檢測效率和準確度都非常高。另外，本研究所納入的樣本組織特性均一、代表性強，基本涵蓋了浸潤性乳腺癌的所有分子分型，使得差異表達的結果可靠性較強。

競爭性內源ceRNA學說揭示了RNA分子間相互作用的新機制。在生理和病理條件下，各種相關基因和ceRNA網絡緊密交織在一起。不同類別的ncRNA的功能多樣性及其相互作用的可塑性增加了可能在惡性腫瘤中脫軌的多層調控通路，最終導致了癌癥的發(fā)展和進展[19]。多項研究表明，ceRNA網絡可調控乳腺癌的方方面面。Linc-ROR通過miR-194-3p靶向MECP2促進乳腺癌的進展并降低對雷帕霉素的敏感性[20]；長非編碼RNA LINC00511通過誘導miR-185-3p/E2F1/Nanog軸參與乳腺癌的發(fā)生和莖化[21]；LncRNA-CDC6通過miRNA-215作為靶向CDC6的ceRNA促進乳腺癌的進程[22]；LINC00673被YY1激活后通過miR-515-5p/MARK4/Hippo信號通路促進乳腺癌細胞的增殖[23]；最近的一項在乳腺浸潤性癌中的研究表明，兩個NEAT1相關ceRNA的異常表達可能導致TP53突變患者對他莫昔芬治療的不良反應，提示ceRNA網絡可以作為預測不同癌癥藥物反應的工具[24]。在本研究所構建的ceRNA網絡中，位于關鍵節(jié)點的3個miRNAs在乳腺浸潤性導管癌組織中均下調表達，與多篇文獻報道一致。miR-152作為腫瘤抑制因子在乳腺癌中下調表達，可通過靶向PIK3CA來抑制AKT和RPS6的激活，進而抑制乳腺癌細胞系HCC1806的增殖，也可通過負調控褪黑素來抑制三陰性乳腺癌血管生成因子，還可靶向SPIN1通過上調藥物代謝酶和藥物轉運體的表達增強乳腺癌的阿霉素耐藥性[25-27]。miR-378d可經化療產生，通過激活 EZH2/STAT3 信號通路促進乳腺癌的干性和耐藥性, 因此，在化療期間阻斷這種適應機制可能會減少化療耐藥性的發(fā)展并最大限度地提高乳腺癌的治療效果[28]。miR-758-3p以lncRNA DANCR-miR-758-3p-PAX6的ceRNA分子網絡形式調控乳腺癌細胞的凋亡和自噬[29]。ceRNA的作用機制提示，本文所構建的特異性ceRNA網絡中的重要節(jié)點RNAs，很有可能是參與乳腺浸潤性導管癌發(fā)生和進展的關鍵因子。

綜上所述，lncRNA可以調節(jié)各種細胞過程，它們作為競爭性miRNA的誘餌作用，通過ceRNA網絡來調節(jié)各種癌癥中的基因表達。本研究成功構建了乳腺浸潤性導管癌中關鍵lncRNA相關的ceRNA特異性網絡，這些發(fā)現有利于為進一步研究乳腺癌基因間的調控機制提供了新的思路和研究方向。下一步，我們將繼續(xù)探索與這4個lncRNAs分別發(fā)生作用的miRNAs以及mRNAs，采用體內體外實驗來驗證它們在乳腺癌的功能。

利益相關聲明：全體作者都閱讀并同意最終的文本，所有作者均沒有利益沖突。

作者貢獻說明：高建是本研究的實驗設計者和負責人，完成數據分析和論文初稿的寫作，金亦負責標本的收集、臨床診斷和臨床表型分析以及臨床資料的整理和隨訪，林潔負責芯片實驗的操作，林圣完成數據的挖掘分析，段山指導實驗設計并參與論文的校對和定稿等。中山大學第三附屬醫(yī)院是本研究的合作單位，主要負責樣本的提供。