鄒暉, 李朝暉, 左園林, 張曄, 吳堪葵

1廣州市花都區(qū)婦幼保健院(胡忠醫(yī)院)、廣東醫(yī)科大學(xué)附屬廣州花都醫(yī)院口腔治療中心(廣東廣州 510800)； 2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科(廣東廣州 510632)； 3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔科(廣東廣州 510260)

正畸力作用下的正畸牙移動(dòng)(orthodontic tooth movement，OTM)是基于牙周支持組織中的力所驅(qū)動(dòng)的組織反應(yīng)。但對于OTM牙周組織中導(dǎo)致最佳機(jī)械條件和生物反應(yīng)的力水平存在爭議。當(dāng)前研究對于將正畸力轉(zhuǎn)化為所需的正畸移動(dòng)而減少不良反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞及分子機(jī)制仍然知之甚少[1-2]。牙周組織對正畸力的反應(yīng)是多種蛋白質(zhì)之間復(fù)雜交互作用的結(jié)果，包括趨化因子、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等。以整體方式評估蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)是理解牙周組織對正畸力的大小和持續(xù)時(shí)間的反應(yīng)的關(guān)鍵[3]。目前文獻(xiàn)中有大量證據(jù)表明，齦溝液(gingival crevicular fluid，GCF)反映了OTM期間細(xì)胞功能活動(dòng)的程度，齦溝液中攜帶大量參與骨和軟組織重塑過程的炎癥介質(zhì)，其中細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)和趨化因子等[1]。在OTM早期，急性炎癥反應(yīng)對隨后的骨吸收有害，骨吸收似乎受促炎細(xì)胞因子控制，這些細(xì)胞因子可以激活前列腺素、膠原酶和核因子-κB配體受體激活劑的釋放[4]。正畸力的施加可以誘導(dǎo)IL-1的表達(dá)，尤其是在正畸治療的早期階段。此外，正畸力可以使牙周韌帶(periodontal ligament，PDL)重塑，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是在PDL重塑中起核心作用的酶[5]，金屬蛋白酶組織抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)可以抑制其活性。趨化因子與中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞趨化和破骨細(xì)胞分化有關(guān)，在OTM過程中骨重塑中起重要作用[6]。盡管證據(jù)有限，但一些臨床研究表明，組織蛋白酶K(Cathepsin K)是破骨細(xì)胞中特征性高表達(dá)的溶酶體酶，主要參與骨膠原纖維的降解，在骨組織破壞吸收及重建過程中起著關(guān)鍵作用，它對OTM的激活反應(yīng)尚未得到廣泛研究[7]。本次研究通過ELISA法觀察不同矯治力對口腔正畸患者齦溝液中IL-1β、TIMP-2、MMP-2、Cathepsin K表達(dá)量的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在2019 年12月至2020年12月期間，從廣州市花都區(qū)婦幼保健院(胡忠醫(yī)院)口腔正畸科門診患者中選擇自愿參加本研究的口腔正畸患者90例，男38例，女 52例，年齡 12～18歲，平均(15.01±2.10)歲，隨機(jī)分為A、B、C三組，施加矯治力分別為0 g、100 g、150 g。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)牙周炎患者；(2)在研究近1個(gè)月和研究過程中使用抗生素或抗炎藥物；(3)患全身系統(tǒng)性疾病者。

本項(xiàng)研究經(jīng)廣州市花都區(qū)婦幼保健院(胡忠醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-010)。

1.2 方法

1.2.1 正畸治療 在拔除上下頜第一前磨牙后，所有受試者都接受了口腔衛(wèi)生指導(dǎo)，并被建議在實(shí)驗(yàn)前1個(gè)月和整個(gè)研究期間進(jìn)行軟食飲食和雙側(cè)咀嚼。為了防止牙菌斑形成和牙周疾病的發(fā)生，所有受試者每天用復(fù)方氯已定含漱液(江蘇晨牌邦德藥業(yè)有限公司)漱口2次，直至研究結(jié)束。

所有入組該研究的患者均采用0.022×0.028英寸系統(tǒng)的Damon Q直絲弓托槽(Ormco公司, 美國)，使用0.017×0.025英寸不銹鋼矩形方絲(埃蒙迪公司，中國)，確保在片段弓絲放人時(shí)兩側(cè)尖牙均不受力；隨機(jī)進(jìn)入B、C組的患者其右側(cè)上頜尖牙用鎳鈦螺旋彈簧(AWCS10506D，埃蒙迪公司，中國)，鎳鈦螺旋彈簧兩端均用0.011英寸結(jié)扎絲(Masel公司，美國)分別固定于實(shí)驗(yàn)側(cè)上頜尖牙和上頜第一磨牙上，通過近中結(jié)扎絲的長短的調(diào)整控制牽引力的大小，用桿式測力計(jì)(杭州奧杰醫(yī)療器械有限公司)測量分別施加100 g或150 g的連續(xù)力，進(jìn)入A組的患者施加0 g的初始力。

1.2.2 齦溝液的收集 采集時(shí)間點(diǎn)如下:施加矯治力前0 d (T0)，施加矯治力后的1 d(T1)、3 d(T2)、7 d(T3)、14 d(T4)。清潔上頜右側(cè)尖牙牙面，使用棉卷隔濕以免除唾液污染，使用氣槍輕吹干牙面及周圍牙齦。在上頜右側(cè)尖牙遠(yuǎn)中齦溝處輕輕插入長8 mm寬2 mm濾紙條(whatman)直至有阻力后靜置60 s獲得的GCF樣本。重復(fù)收集3次以獲得足量GCF，將其放入1.5 mL離心管中，隨后將樣本放入-70℃冰箱中保存。

1.2.3 IL-1β、TIMP-2、MMP-2、Cathepsin K含量測定 取出GCF樣本在室溫下完全解凍，在離心管中加入150 μL PBS磷酸緩沖液，震蕩2次，2 min/次，隨后離心10 min(3 000 r/min)。通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測樣本中IL-1β、TIMP-2、MMPs-2、Cathepsin K含量。試劑盒購自伊艾博醫(yī)療有限公司，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 不同矯正力對齦溝液IL-1β的影響 A組為對照組，患者齦溝液中IL-1β濃度保持在穩(wěn)定的基線水平，在各時(shí)間點(diǎn)IL-1β濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。B組和C組患者齦溝液中IL-1β含量變化趨勢相似，兩組加力后IL-1β濃度開始緩慢升高，T2時(shí)達(dá)到高峰，之后又緩慢下降，T4時(shí)恢復(fù)至加力前水平。與A組比較，B組、C組T1～T3時(shí)IL-1β濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在同組中與加力之前比較，T1～T3時(shí)IL-1β濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表1。

表1 齦溝液中IL-1β的含量變化

2.2 不同矯正力對齦溝液TIMP-2的影響 A組為對照組，患者齦溝液中TIMP-2濃度保持在穩(wěn)定的基線水平，TIMP-2濃度在各時(shí)間點(diǎn)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。B組和C組患者齦溝液中TIMP-2含量變化趨勢相似，加力后至T2時(shí)齦溝液中 TIMP-2濃度緩慢升高，T2～T3 TIMP-2濃度迅速升高，T3時(shí)達(dá)到峰值，之后又迅速下降，T4時(shí)雖然下降幅度明顯，但仍高于T0水平。與A組比較，B組、C組T1～T4時(shí)TIMP-2濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在同組中與T0時(shí)比較，加力后T1～T4時(shí)TIMP-2濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且濃度均高于T0時(shí)(P<0.05)，見表2。

表2 齦溝液中TIMP-2的含量變化

2.3 不同矯正力對齦溝液MMP-2的影響 A組為對照組，患者齦溝液中MMP-2濃度保持在穩(wěn)定的基線水平，MMP-2濃度在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。B組和C組患者齦溝液中MMP-2含量變化趨勢相似，在加力后至T2時(shí)齦溝液中MMP-2濃度開始緩慢升高，T3時(shí)達(dá)到高峰，之后迅速下降，T4時(shí)MMP-2濃度仍高于T0時(shí)水平(P<0.05)。與A組比較，B組、C組T1～T4時(shí)MMP-2濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在同組中與T0時(shí)比較，T1～T4時(shí)MMP-2濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且濃度均高于T0時(shí)(P<0.05)，見表3。

表3 齦溝液中MMP-2的含量變化

2.4 不同矯正力對齦溝液Cathepsin K的影響 A組為對照組，患者齦溝液中Cathepsin K濃度保持在穩(wěn)定的基線水平，Cathepsin K濃度在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。B組和C組患者齦溝液中Cathepsin K含量變化趨勢相似，在加力后至T3時(shí)齦溝液中Cathepsin K升高達(dá)到高峰，之后開始下降，T4時(shí)仍然高于加力前水平(P<0.05)。與A比較，B組、C組T1～T4時(shí)Cathepsin K濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在同組中與T0時(shí)比較，加力后T1～T4時(shí)Cathepsin K濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且濃度均高于T0時(shí)(P<0.05)，見表4。

表4 齦溝液中Cathepsin K的含量變化

3 討論

由于組織或細(xì)胞對機(jī)械刺激的反應(yīng)，正畸力誘導(dǎo)牙周組織重塑。目前已有多項(xiàng)研究以確定正畸牙齒移動(dòng)中的最佳力值范圍。據(jù)報(bào)道，人類牙齒移動(dòng)的最佳力的范圍輕至18 g重至1 515 g，但在臨床正畸治療中并沒有循證醫(yī)學(xué)的最佳力值可推薦。在臨床治療中除了對牙齒移動(dòng)速度最佳的力之外，還需關(guān)注施加正畸力后的炎癥反應(yīng)發(fā)生[8]。齦溝液是一種生理性液體，同時(shí)也是炎性滲出物，含有炎癥標(biāo)志物、生長因子和其他蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)對于骨重塑過程均有影響[9]。在此前提下，本次研究主要觀察不同矯治力對口腔正畸患者齦溝液IL-1β、TIMP-2、MMP-2、Cathepsin K的表達(dá)影響。

IL-1β已被證明是激活破骨細(xì)胞活性并趨化白細(xì)胞和其他細(xì)胞介質(zhì)來處理骨重塑的最有效的細(xì)胞因子[10]。它是第一個(gè)通過機(jī)械應(yīng)力調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成的免疫細(xì)胞功能的多肽介質(zhì)。此外，IL-1β是炎癥介質(zhì)之一，其誘導(dǎo)產(chǎn)痛物質(zhì)的分泌。更重要的是，IL-1β可由牙周韌帶(PDL)產(chǎn)生，其量足以擴(kuò)散到齦溝液中，并且已經(jīng)被鑒定為正畸牙移動(dòng)的生物標(biāo)志物。當(dāng)正畸力施加到牙齒上時(shí)，來自矯治力的機(jī)械應(yīng)力引起牙骨質(zhì)中和牙周支持組織中的許多細(xì)胞種類、結(jié)構(gòu)、生化反應(yīng)發(fā)生變化，并導(dǎo)致早期正畸牙移動(dòng)期間的急性炎癥反應(yīng)[11-12]。本次研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)間段，施加矯治力后IL-1β較對照組顯著升高，且相比本組施加矯治力前，第3天達(dá)到峰值，提示不同矯治力對于IL-1β影響較明顯，且施加作用力越大，患者齦溝液IL-1β分泌量越多，炎癥反應(yīng)越大。

正畸牙移動(dòng)過程中，周圍組織中膠原酶會(huì)發(fā)生變化，其中包括MMP-2以及MMP 的特異性抑制因子TIMPs。MMP是鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，包含超過25種酶，可調(diào)節(jié)許多生物過程，在PDL重塑中起核心作用的酶[13]。MMP是炎癥介質(zhì)之一，有研究顯示，MMP-2和TIMP-2的表達(dá)在正畸過程中的壓力和張力部位均上調(diào)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-2在不同矯治力作用下，濃度不同程度提高，與同時(shí)間點(diǎn)對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高于本組矯治前。TIMP-2、MMP-2的變化趨勢具有一致性，提示MMP 和 TIMP 協(xié)同產(chǎn)生，且與施加力呈正相關(guān)性。

蛋白水解過程是破骨細(xì)胞骨吸收的關(guān)鍵，骨基質(zhì)蛋白的降解是由破骨細(xì)胞分泌到骨吸收腔隙中的酸性溶酶體蛋白酶啟動(dòng)的，然后在細(xì)胞內(nèi)溶酶體系統(tǒng)中繼續(xù)并完成[15]。到目前為止，已經(jīng)在吸收活躍的破骨細(xì)胞的腔隙和溶酶體樣細(xì)胞器中鑒定出多種溶酶體蛋白酶。在溶酶體蛋白酶中，Cathepsin K尤為特殊，因?yàn)樵撁钢饕谄乒羌?xì)胞中表達(dá)，并能在酸性條件下有效降解骨基質(zhì)蛋白[16]。Cathepsin K可視為牙周炎牙槽骨吸收的重要標(biāo)記物，研究發(fā)現(xiàn)其在齦溝液中的含量隨著牙周炎的加重而增加[17]。相關(guān)大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)施加正畸力12 h后Cathepsin K在破骨細(xì)胞中的表達(dá)逐漸增加，在第3天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，幾乎恢復(fù)到加力前[18]。本次研究發(fā)現(xiàn)Cathepsin K在各時(shí)間點(diǎn)相較對照組，均不同程度升高，且在第7天達(dá)到峰值，之后逐漸下降，第14天仍然高于加力前水平；且與本組施加矯治力前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示不同矯治力可導(dǎo)致Cathepsin K表達(dá)增加，其表達(dá)量與力值呈相關(guān)性。

本次研究結(jié)果證實(shí)，在不同矯治力作用下，IL-1β、TIMP-2、MMP-2、Cathepsin K的表達(dá)隨時(shí)間延長呈現(xiàn)規(guī)律性的增減變化。檢測齦溝液中IL-1β、TIMP-2、MMP-2、Cathepsin K的動(dòng)態(tài)變化有助于研究正畸過程中正畸力值及加力時(shí)間是否適宜，一定程度上也說明施加正畸力后牙周組織會(huì)發(fā)生改建，這種改建活動(dòng)在單次加力后出現(xiàn)先逐漸增強(qiáng)，后逐漸減弱的變化趨勢，至14 d 時(shí)基本穩(wěn)定。因此檢測齦溝液中IL-1β、TIMP-2、MMP-2、Cathepsin K的濃度能夠幫助正畸醫(yī)師使用正畸力獲得最佳的牙齒移動(dòng)，正畸醫(yī)師可利用IL-1β、TIMP-2、MMP-2、Cathepsin K作為檢測最佳牙齒移動(dòng)持續(xù)時(shí)間的指標(biāo)，以避免發(fā)生病理性的牙槽骨吸收、牙根吸收。但是本次研究過程中未研究大于150 g的正畸力，牙齒移動(dòng)骨再建是一個(gè)復(fù)雜而連續(xù)的過程，要探究最適合牙齒移動(dòng)的最佳力，不同矯治力作用下牙周組織改建過程中IL-1β、TIMP-2、MMP-2、Cathepsin K 的相互作用仍需進(jìn)一步研究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：鄒暉直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)；起草論文，統(tǒng)計(jì)分析。李朝暉對論文的知識性內(nèi)容作批評性審閱，指導(dǎo)、支持該項(xiàng)工作。左園林實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)。張曄直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；獲取研究經(jīng)費(fèi)，支持該項(xiàng)工作。吳堪葵直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究。