◆作者：亓秀曄 劉乃芝 郭楊麗 徐海燕

◆單位：山東寶來利來生物工程股份有限公司山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室

近年來，抗生素的危害愈發(fā)嚴重，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已于2020年發(fā)文在飼料端禁抗，而益生菌發(fā)酵飼料由于具有無污染、品質(zhì)高、適口性好、利用率高、可部分替代抗生素等優(yōu)點被廣泛關(guān)注（鐘晨等，2020）。益生菌發(fā)酵可將飼料原料分解成多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等一些大分子物質(zhì)，生成有機酸、可溶性小肽等小分子物質(zhì)和大量的菌體蛋白，形成營養(yǎng)豐富、適口性好的生物飼料（萬里等，2021；萬里等，2022）。乳酸菌是應(yīng)用最早、最廣泛的益生菌，是一類對宿主有益的活性微生物，其可以改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道的微生態(tài)平衡，提高宿主的免疫力等功能（李金澤等，2021）。酵母菌屬于兼性厭氧型真菌，其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酒香味或蘋果芳香味，從而提高飼料風味和動物采食量，還可通過自身產(chǎn)生的酶將飼料中的大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，進而提高飼料利用率（鄒春悅，2018）。已有大量研究表明，在動物飼糧中添加適量的乳酸菌、酵母菌等益生菌可以提高動物的生產(chǎn)性能，改善肉品質(zhì)（余淼等，2013），優(yōu)化血液生化指標（SURYANTO 等,2014），提高反芻動物瘤胃功能等（WANAPAT等，2021）。

本試驗旨在研究適宜肉鴨全價飼料發(fā)酵的益生菌的篩選，并用篩選得到的益生菌發(fā)酵肉鴨全價料，對影響益生菌固態(tài)發(fā)酵過程中的3 個主要因素：發(fā)酵時間、初始料水比和發(fā)酵溫度進行優(yōu)化，為益生菌發(fā)酵肉鴨全價飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵基料和菌株

肉鴨全價飼料；6 株乳酸菌菌株：BLCC2-0111、BLCC2-0112、BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2- 0001、BLCC2-0114；6 株酵 母 菌 菌 株：BLCC4-0016、BLCC4-0018、BLCC4-0021、BLCC4-0048、BLCC4-0050、BLCC4-0327，均由山東寶來利來生物工程股份有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌發(fā)酵用MRS 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏8 g/L、酵母膏4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸錳0.3 g/L、檸檬酸銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 1 ml/L，pH 值6.0，121 ℃滅菌20 min。計數(shù)用培養(yǎng)基為乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（LBS）。

酵母菌發(fā)酵用培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏0.5 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L、pH自然，121℃滅菌20min。計數(shù)用培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備

將4 ℃保存條件下的乳酸菌斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100 mL MRS 培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h 備用。將4℃條件下保存的酵母斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有50 mL 酵母培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h 備用。

1.2.2 乳酸菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比5∶3 配制好，裝袋，裝袋量為100 g/袋，每個樣品設(shè)3 個平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳酸菌種子液，以不接種任何菌株的空白料為對照，壓實后于37 ℃培養(yǎng)箱進行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48 和72 h 取樣，測定pH 值、活菌數(shù)和總酸含量。

1.2.3 酵母菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比5∶3 配制好，裝入500 mL 三角瓶中，裝量50 g/瓶，每個樣品設(shè)3 個平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，以不接種任何菌株的空白料為對照，混勻后置于30 ℃培養(yǎng)箱進行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48 和72 h 取樣，測定活菌數(shù)和粗蛋白含量。

1.2.4 最適益生菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

將篩選得到的乳酸菌和酵母菌分別發(fā)酵肉鴨全價飼料，2%接種量，發(fā)酵時間：24、48、72 h；初始料水比為5∶2、5∶3 和5∶4；發(fā)酵溫度為常溫（22~25℃）、25、28、32、37 和42℃，測定發(fā)酵料pH、粗蛋白、活菌數(shù)，考查不同初始料水比和發(fā)酵溫度對飼料品質(zhì)的影響。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 樣品pH 測定

取10 g 樣品加入90 mL 滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

1.3.2 活菌數(shù)的測定

準確稱取發(fā)酵飼料10.0 g，用生理鹽水10 倍遞增稀釋，取適當稀釋度的樣品分別至LBS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37 ℃和30 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計算樣品中乳酸菌和酵母菌數(shù)量，結(jié)果用CFU/g表示。

1.3.3 總酸含量的測定

采用酸堿滴定法測定樣品中總酸含量。參照國標GB/T 12456-2008，樣品中總酸的測定，即根據(jù)酸堿中和原理，用堿液滴定試液中的酸，以酚酞為指示劑確定滴定終點，按堿液的消耗量計算樣品中的總酸含量。

1.3.4 粗蛋白含量的測定

采用凱氏定氮法測定樣品中粗蛋白含量。參照GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 軟件進行初步處理后，采用SPSS 13.0 進行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA 進行方差分析，LSD 法進行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜肉鴨全價料發(fā)酵的乳酸菌的篩選

由表1 可以看出，pH 值方面：隨著發(fā)酵時間延長，各菌株pH 值均出現(xiàn)降低的趨勢，BLCC2-0111 在發(fā)酵至24h 時pH 值已降至較低水平，至72 h時pH 值降至最低為4.03，其次為BLCC2-0112，72 h 時pH 值為4.13，與BLCC2-0111 相比差異不顯著, 均顯著低于其他組（P＜0.05）。活 菌 數(shù) 方 面：以BLCC2-0111 和BLCC2-0112 發(fā)酵后活菌數(shù)較高，24 h 和48 h時，除對照組和BLCC2-01114外，前兩者顯著高于其他組（P＜0.05），72 h 時，前兩者顯著高于其他菌株（P＜0.05）。綜合來看，最適肉鴨全價料發(fā)酵的乳酸菌為BLCC2-0111。

表1 6 株乳酸菌發(fā)酵肉鴨全價料對pH 值和活菌數(shù)的影響

2.2 適宜肉鴨全價料發(fā)酵的酵母菌的篩選

由表2 可以看出，BLCC4-0050 在發(fā)酵至24 h 時，活菌數(shù)顯著高于其他組1 個數(shù)量級（P＜0.05），72 h 時，除BLCC4-0021 外，顯著高于其他組（P＜0.05）；BLCC4-0021 在24 h 時稍低于BLCC4-0050，48 h 和72 h時高于BLCC4-0050，兩者差異不顯著。BLCC4-0050 和BLCC4-0021 的粗蛋白含量在各時間段內(nèi)均顯著高于其他組（P＜0.05）。綜合來看，適宜肉鴨全價料發(fā)酵的酵母菌菌株為BLCC4-0050和 BLCC4-0021。 后 續(xù) 選 擇BLCC4-0021 進行發(fā)酵工藝優(yōu)化。

表2 6 株酵母菌發(fā)酵肉鴨全價料對活菌數(shù)（CFU/g）的影響

2.3 乳酸菌BLCC2- 0111 發(fā)酵工藝優(yōu)化

由表3 可以看出：常溫（22~25℃）發(fā)酵24 h 時，與其他溫度相比，各料水比下活菌數(shù)最低，pH 值最高在5.5 以上，總酸含量最低；至48 h 時，活菌數(shù)和總酸含量與24 h 變化不大，但pH 值有所降低，特別是5∶3 和5∶4 時的pH 均下降至5.00 以下；至72 h 時，各料水比下，活菌數(shù)上升1 個數(shù)量級，總酸含量也有所提高，pH 下降，特別是料水比5∶3 時，pH 下降至較低為4.31。42℃時，發(fā)酵24~48 h 時，與常溫規(guī)律一致，菌體生長較慢；72 h 時，活菌數(shù)在各料水比下均較低，低于其他組可達到1個數(shù)量級，但總酸含量較高，高于常溫組，此時從物理性狀來看，尤其是5：4 時，發(fā)酵料結(jié)塊，粘性增加，不利于后續(xù)發(fā)酵。整體來看，常溫（22~25℃）或42℃時，即溫度過低或過高，均影響乳酸菌生長，至少48 h 以后才發(fā)酵起來。

表3 乳酸菌BLCC2-0111 發(fā)酵工藝優(yōu)化

28℃和32℃時，發(fā)酵至24 h，料水比5∶2 時，活菌數(shù)較低，pH 較高，發(fā)酵較慢，發(fā)酵至48 h時料水比5 ∶2 活菌數(shù)低于37℃，其他情況下活菌數(shù)升至十億水平，pH 降至較低水平，總酸含量升高。37℃時，發(fā)酵至24 h時，活菌數(shù)已升至10 億水平，料水比5∶3 和5∶4 時，pH 已降至較低水平，4.30 以下?？偹岷恳恢痹谳^高水平，發(fā)酵至72 h時，各料水比下，28~42℃總酸含量顯著高于其他組（P＜0.05）。

綜合活菌數(shù)、pH 值和總酸含量得出：適宜乳酸菌BLCC2-0111 生料發(fā)酵的最優(yōu)條件為：溫度28~32℃、料水比5∶3 或5∶4；溫度37℃，料水比5∶2、5∶3或5∶4，發(fā)酵時間24~72h。此條件下，活菌數(shù)最高達64×108CFU/g，pH 值最低為3.95，總酸含量最高為22.51mg/g。

2.4 酵母菌BLCC4- 0021 菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化

由表4 可以看出，常溫（22~25℃）和25℃發(fā)酵24 h 時活菌數(shù)較低，至48 h 時才發(fā)酵起來，而料水比5∶4 條件下發(fā)酵尤其緩慢；粗蛋白含量方面，發(fā)酵至24 h 時，各料水比下常溫顯著低于25℃；發(fā)酵至48h 時，料水比5∶2 和5∶3 時常溫組和25℃差異不顯著，料水比5∶4時，常溫顯著低于25℃。整體來看，溫度較低不利于酵母菌發(fā)酵，5∶4 的料水比濕度較大也不利于酵母菌發(fā)酵。

表4 酵母菌BLCC4-0021 菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化

28℃時，發(fā)酵至24 h 時活菌數(shù)與常溫和25℃一致，均在億水平，但粗蛋白含量升高明顯，48 h以后，活菌數(shù)均在十億水平，粗蛋白含量與25℃差異不顯著。32~37℃時，發(fā)酵至24 h 時，活菌數(shù)接近十億水平，粗蛋白含量也升高，顯著低于常溫、25 和28℃。

此外還可以看出，BLCC4-0021 在各個溫度下料水比為5∶3 時發(fā)酵活菌數(shù)最高，且質(zhì)地疏松不干燥無結(jié)塊；料水比5∶4時的活菌數(shù)隨著時間延長，差距逐漸增大，24 h 最小，72 h 最大，說明5∶4 料水比時料太濕，不利于酵母菌的生長，且5∶4 料水比的發(fā)酵條件下結(jié)塊非常嚴重，而5∶2 的料水比會略顯干燥，需要稍長時間才發(fā)酵起來。整體來看， 適宜酵母菌BLCC4-0021 發(fā)酵的最優(yōu)條件為：25~28℃，料水比5∶2 或5∶3，發(fā)酵時間48~72 h；32~37℃，料水比5∶2 或5∶3，發(fā)酵時間24~72 h。此條件下，活菌數(shù)最高達56×108CFU/g，粗蛋白含量最高達17.87%。

3 結(jié)論

本試驗對適宜肉鴨全價飼料發(fā)酵的益生菌進行了篩選，并對最適發(fā)酵菌種的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最適肉鴨全價料發(fā)酵的益生菌為乳酸菌BLCC2-0111 和酵母菌BLCC4-0021；適宜乳酸菌BLCC2-0111發(fā)酵的最優(yōu)條件為：溫度28~32℃、料水比5∶3 或5∶4；溫度37℃，料水比5∶2、5∶3 或5∶4，發(fā)酵時間24~72 h。此條件下，活菌數(shù)最高達64×108CFU/g，pH值最低為3.95，總酸含量最高為22.51mg/g。 適 宜 酵 母 菌BLCC4-0021 發(fā)酵的最優(yōu)條件為：25~28℃，料水比5∶2 或5∶3，發(fā)酵時間48~72 h；32~37℃，料水比5∶2 或5∶3，發(fā)酵時間24~72 h。此條件下，活菌數(shù)最高達56×108CFU/g，粗蛋白含量最高達17.87%。