仇曉夏，常 成

(1.江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226000； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210017)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)[1]是高血壓、肥胖、血脂異常、遺傳、糖尿病等多種因素作用于不同環(huán)節(jié)引起的疾病，其主要病理特點(diǎn)為脂質(zhì)沉積，可伴有平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)增生[1-2]。AS可引起嚴(yán)重的心臟病和腦卒中，約占所有心腦血管疾病死亡人數(shù)的50%[3]。越來越多的證據(jù)[4-5]證明，腸道菌群與AS等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為疾病治療的新靶點(diǎn)。

AS隨年齡的增長而發(fā)病率逐漸增加，可導(dǎo)致腦卒中、冠心病等疾病，辨證屬于氣虛血瘀證的，治以益氣活血法，臨床常以黃芪-丹參作為基礎(chǔ)方進(jìn)行加味。其中，黃芪補(bǔ)氣，丹參活血，二者合用，共奏益氣活血、推陳出新之功[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[7-8]表明，黃芪-丹參可通過多種途徑和靶點(diǎn)增強(qiáng)免疫功能、擴(kuò)張血管、增強(qiáng)心肌收縮力和抑制血栓形成，廣泛用于心腦血管疾病的治療。目前，黃芪-丹參干預(yù)AS的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究基于腸道菌群角度，初步探究黃芪-丹參治療AS的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量(220±20)g，購自杭州醫(yī)學(xué)院[生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2019-0002]。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物及試劑 黃芪(批號20210118)、丹參(批號20210203)飲片均購自南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，經(jīng)該院藥劑科徐宏彬主任鑒定為正品，憑證標(biāo)本存放在該院。辛伐他汀片(國藥準(zhǔn)字 H20083839，每片20 mg)：山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司；維生素D3注射液(國藥準(zhǔn)字 H20058981，每支30萬單位)：浙江仙琚制藥股份有限公司；4%多聚甲醛(批號 BL539A)：Biosharp公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(貨號 SEKR-0009)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)(貨號 SEKR-0005)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(貨號 SEKR-0002)：北京索萊寶科技公司；蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)(批號 BP-DL001)：南京森貝伽生物公司；普通飼料、高脂飼料(含2%膽固醇、10%豬油、88%普通飼料)：江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、E.Z.N.A.?DNA抽提試劑盒、ELISA試劑盒、NEXTFLEX?DNA試劑盒：上海美吉生物公司。

1.3 儀器與設(shè)備 生物顯微鏡(型號BX53)：日本Olympus公司；酶聯(lián)免疫檢測儀(型號 Multiskan MK3)：美國Thermo公司；全自動(dòng)生化分析儀(型號 Hitachi7170A)：日本日立公司；病理切片機(jī)(型號 RM2235)：德國Leica公司；光度計(jì)(型號 ND2000)、核酸電泳儀(型號 DYY-6C)、高靈敏熒光計(jì)(型號 QuantusTM)、PCR儀(型號 9700)、測序平臺(型號 Miseq PE300)：美吉生物公司。

2 方法

2.1 黃芪-丹參水煎液制備 取黃芪30 g、丹參15 g，稱取藥材后加入10倍容積水浸潤2 h后煎煮，煎煮1 h后過濾，隨后濾渣加入8倍容積水繼續(xù)煎煮1 h，合并2次濾液并濃縮[9]，最后得到生藥量為1.0 g/mL黃芪-丹參水煎液，保存于4 ℃環(huán)境中備用。

2.2 大鼠模型的復(fù)制及分組 將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組(空白組、模型組、辛伐他汀組和黃芪-丹參組)，每組6只?？瞻捉M大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[9]方法復(fù)制AS動(dòng)物模型，即每日以高脂飼料喂養(yǎng)，第3天腹腔注射7×105U/kg維生素D31次，持續(xù)喂養(yǎng)8周。模型復(fù)制同時(shí)灌胃給藥，其中辛伐他汀組給予1 mg/kg(為60 kg成人劑量)辛伐他汀，黃芪-丹參組給予0.75 g/kg(60 kg成人劑量)黃芪-丹參水煎液，空白組和模型組給予等容積生理鹽水，每天灌胃1次。

2.3 動(dòng)物處死與取材 采用二氧化碳吸入法處死大鼠，處死方法符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。具體方法：末次給藥后禁食12 h，隨后置于安樂死箱內(nèi)，充滿100%二氧化碳(每分鐘置換率為10%～30%箱內(nèi)體積)，隨后采集大鼠血清，用液氮速凍結(jié)腸內(nèi)容物，4%多聚甲醛固定保留胸主動(dòng)脈。

2.4 大鼠血脂及細(xì)胞因子水平檢測 3 500 r/min離心，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triacylglycerol, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)水平，依據(jù)ELISA試劑盒步驟檢測血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2.5 大鼠胸主動(dòng)脈病理學(xué)檢查 取固定后的胸主動(dòng)脈，使用梯度濃度乙醇及二甲苯脫水，石蠟包埋，儲存?zhèn)溆?。將上述胸主?dòng)脈蠟塊切片并脫蠟，根據(jù)說明書進(jìn)行HE染色，隨后使用顯微鏡觀察并拍照。

2.6 結(jié)腸內(nèi)容物DNA抽提和PCR擴(kuò)增 依據(jù)DNA抽提試劑盒說明書，抽提各組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物腸道菌群總DNA，通過凝膠電泳法檢測其質(zhì)量，通過紫外分光光度法對其DNA進(jìn)行定量分析?；?38F-806R測序區(qū)域進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系與文獻(xiàn)[10]的方法一致。

2.7 結(jié)腸內(nèi)容物Illumina Miseq測序 依據(jù)DNA凝膠回收試劑盒說明書，純化回收的PCR產(chǎn)物。通過凝膠電泳檢測其質(zhì)量，通過熒光法對其進(jìn)行定量分析。按照DNA快速測序試劑盒說明書建庫并在IlluminaMiseq PE300平臺測序，得到原始序列。將上述序列導(dǎo)入Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)量控制，并通過Flash進(jìn)行拼接，質(zhì)量控制及拼接參數(shù)與文獻(xiàn)[10]的方法一致，優(yōu)化序列。

2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 運(yùn)用生信云(https://cloud.majorbio.com/)將處理后的序列歸為多個(gè)無嵌合體操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)(97%相似度)；利用Uparse云軟件(v7.0.1090)進(jìn)行OTU分析、Alpha多樣性分析、稀釋曲線分析和Rank-Abundance曲線分析；利用生信云tax_summary_a文件夾中數(shù)據(jù)進(jìn)行群落組成分析；利用Qiime云軟件(v1.9.1)和R云軟件(v3.3.1)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)、主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)和非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling,NMDS)；利用R云軟件(v3.3.1)和Python云軟件(v3.9)進(jìn)行組間比較；利用生信云進(jìn)行LEfSe多級物種差異比較。以上云均由美吉生物公司提供。

3 結(jié)果

3.1 4組大鼠血脂水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高(P<0.05)，HDL-C水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，辛伐他汀組和黃芪-丹參組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低(P<0.05)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05)。結(jié)果提示AS大鼠出現(xiàn)高脂血癥，而黃芪-丹參可改善AS大鼠血脂水平。見圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.黃芪-丹參組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖1 4組大鼠血脂水平比較

3.2 4組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，辛伐他汀組和黃芪-丹參組TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)果提示黃芪-丹參可抑制AS大鼠炎癥水平。見圖2。

注：A.空白組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.黃芪-丹參組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖2 4組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

3.3 4組大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)變化比較 空白組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮光滑，無明顯損傷，呈健康狀態(tài)；模型組大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，可見明顯藍(lán)色鈣狀斑塊；辛伐他汀組和黃芪-丹參組大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮無明顯損傷及增厚，大致恢復(fù)正常。結(jié)果提示黃芪-丹參可抑制AS大鼠動(dòng)脈硬化。見圖3。

注：A.空白組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.黃芪-丹參組圖3 4組大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)變化(HE染色，10×20倍)

3.4 3組大鼠腸道菌群物種注釋與評估 3組大鼠腸道菌群優(yōu)化后序列數(shù)目為1 433 784，堿基數(shù)目為595 743 075，平均長度為415 bp，序列長度分布在400～440 bp范圍內(nèi)，符合16S rRNA(V3-V4)要求，后續(xù)分析可靠。如圖4a所示，本研究Shannon曲線圖中，各組曲線均趨于平坦，提示各組數(shù)據(jù)量滿足測序要求；其值較高，提示各組微生物多樣性得到較全面反映。如圖4b所示，本研究Rank-Abundance曲線中，各組平緩且較大范圍下降，提示各大鼠腸道菌群物種分布均勻且豐富度高。

圖4 大鼠腸道菌群Shannon曲線(a)和Rank-Abundance曲線(b)

3.5 3組大鼠腸道菌群Alpha多樣性分析 與空白組比較，模型組Berger-Parker指數(shù)和Simpson指數(shù)明顯降低(P<0.05)，提示AS大鼠腸道菌群多樣性明顯下降；與模型組比較，黃芪-丹參組Berger-Parker指數(shù)和Simpson指數(shù)明顯升高(P<0.05)。結(jié)果提示黃芪-丹參可改善AS大鼠腸道菌群多樣性。見圖5。

注：A.空白組；B.模型組；C.黃芪-丹參組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖5 3組大鼠腸道菌群Berger-Parker指數(shù)(a)和Simpson指數(shù)(b)比較

3.6 3組大鼠腸道菌群Beta多樣性分析 3組所有樣本各自聚集在一起，其中模型組與空白組距離較遠(yuǎn)，而空白組、黃芪-丹參組距離較為接近。結(jié)果提示黃芪-丹參可使AS大鼠腸道菌群趨于正常。見圖6。

圖6 3組大鼠腸道菌群Beta多樣性的PCA(a)、PCoA和NMDS(c)結(jié)果

3.7 大鼠腸道菌群物種組成及差異分析

3.7.1 門水平物種組成及差異分析 如圖7a所示，3組大鼠腸道菌群的優(yōu)勢物種主要有7種(篩選條件：群落豐度>0.01%)，為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)。如圖7b、7c、7d所示，與空白組比較，模型組放線菌門群落豐度明顯降低(P<0.05)，變形菌門和疣微菌門群落豐度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪-丹參組放線菌門群落豐度明顯升高(P<0.05)，變形菌門和疣微菌門群落豐度明顯降低(P<0.05)。結(jié)果提示AS大鼠放線菌門豐度降低，變形菌門和疣微菌門豐度升高，而黃芪-丹參可提高AS大鼠上述門水平優(yōu)勢物種群落豐度。

注：A.空白組；B.模型組；C.黃芪-丹參組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖7 3組大鼠腸道菌群門水平組成及差異分析

3.7.2 屬水平物種組成及差異分析 如圖8a所示，3組大鼠腸道菌群在屬水平的優(yōu)勢物種主要有13種(篩選條件：群落豐度>0.03%)，為乳桿菌屬(Lactobacillus)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、unclassified_f_Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬(Blautia)、norank_f_Muribaculaceae、Allobaculum、綠膿桿菌屬(Turicibacter)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、Clostridium_sensu_stricto_1、Ruminococcaceae_UGG-014、unclassified_f_Ruminococcaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group和杜氏桿菌屬(Dubosiella)。如圖8b、8c、8d、8e、8f、8g所示，與空白組比較，模型組乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和杜氏桿菌屬群落豐度明顯降低(P<0.05)，布勞特氏菌屬、unclassified_f_Ruminococcaceae和Lachnospiraceae_NK4A136_group群落豐度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪-丹參組乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和杜氏桿菌屬群落豐度明顯升高(P<0.05)，布勞特氏菌屬、unclassified_f_Ruminococcaceae和Lachnospiraceae_NK4A136_group群落豐度明顯降低(P<0.05)。提示AS大鼠乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和杜氏桿菌屬豐度降低，布勞特氏菌屬、unclassified_f_Ruminococcaceae和Lachnospiraceae_NK4A136_group豐度升高，而黃芪-丹參可提高AS大鼠上述屬水平優(yōu)勢物種群落豐度。

注：A.空白組；B.模型組；C.黃芪-丹參組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖8 3組大鼠腸道菌群屬水平組成及差異分析

4 討論

腸道菌群與宿主長期共同進(jìn)化，參與宿主多種代謝途徑的調(diào)節(jié)，形成與腸道、肝臟和大腦功能相關(guān)的免疫炎癥軸，進(jìn)而對宿主產(chǎn)生全身作用[11]。越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群通過調(diào)控炎癥和代謝產(chǎn)物參與AS等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。腸道菌群失調(diào)衍生的脂多糖可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)及其下游MyD88、核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)，促進(jìn)IL-6、IL-1、IL-27和TNF-α等細(xì)胞因子的生成，進(jìn)而增加患AS的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。腸道菌群代謝或共代謝產(chǎn)物，三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide, TMAO)在血漿中水平與AS形成及AS斑塊大小呈正相關(guān)[15]；次級膽汁酸進(jìn)入門靜脈循環(huán)后作為信號分子介導(dǎo)膽固醇積累、泡沫細(xì)胞和AS斑塊的形成，影響AS的發(fā)生發(fā)展[16-17]。

黃芪、丹參為臨床治療心腦血管疾病的常用藥對。研究顯示，黃芪總皂苷可能通過調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善AS[18]；黃芪多糖可能通過激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶以及抑制尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表達(dá)，抑制糖尿病AS的形成[19]。丹參中酚酸類成分可通過減輕氧化應(yīng)激水平，保護(hù)血管內(nèi)皮功能，改善微循環(huán)等，發(fā)揮抗AS作用[20]；丹參素可能通過調(diào)控TLR-NF-κB通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而呈劑量依賴性地改善AS[21]。本研究顯示，AS大鼠模型血脂水平升高，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯上升，胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，伴有明顯的藍(lán)色鈣狀斑塊。而黃芪-丹參干預(yù)后，大鼠血脂和炎癥因子水平均得到改善，胸主動(dòng)脈病變得到糾正，提示黃芪-丹參對AS大鼠具有明確的治療作用。

高豐度的變形菌門往往是腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志，亦是腸道炎癥的誘因之一[22]。乳桿菌屬為腸道內(nèi)有益菌群，其可激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，抑制輔助性T細(xì)胞，影響巨噬細(xì)胞亞群比例，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫，抑制AS相關(guān)炎癥[23]。雙歧桿菌可通過參與三甲胺(trimethylamine, TMA)-TMAO調(diào)節(jié)和改善脂質(zhì)代謝，最終緩解TMAO引起的AS[24]。本研究顯示，AS大鼠腸道菌群多樣性明顯下降，提示AS疾病進(jìn)展伴隨腸道菌群的失調(diào)。當(dāng)黃芪-丹參干預(yù)后，大鼠腸道菌群多樣性得到恢復(fù)，門和屬水平相應(yīng)優(yōu)勢物種豐度得到糾正，說明黃芪-丹參具有調(diào)節(jié)AS大鼠腸道菌群的作用。

綜上，黃芪-丹參對AS大鼠具有明確的治療作用，該作用可能與其對AS大鼠腸道菌群失調(diào)的改善有關(guān)，研究結(jié)果可為黃芪-丹參臨床治療AS提供有益思路。