許茂玉，盛炎炎，方 祥，周正新，李文華，朱 磊

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 合肥 230031)

膝關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以軟骨和軟骨下骨退變、磨損及滑膜炎癥為特征，以疼痛、畸形和功能障礙為臨床表現(xiàn)的常見慢性筋骨疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。KOA是使老年人致殘的常見疾病之一，與性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、生物力學(xué)等因素有關(guān)[1]。該病好發(fā)于中老年人群，且女性多于男性。

中醫(yī)學(xué)將KOA歸屬于“痹證”“骨痹”范疇[2]。中醫(yī)藥治療KOA由來已久，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就確立了“痹證”的基礎(chǔ)理論體系。中醫(yī)認(rèn)為KOA因肝腎虧虛、筋脈瘀滯所致，總體治療原則以補肝益腎、強筋健骨、活血化瘀為主[3]。中藥治療KOA具有療效確切、安全性高的優(yōu)勢，對KOA的治療具有很好的臨床效應(yīng)，在KOA的診治中起到至關(guān)重要的作用。杜仲的主要功效為補肝腎、強筋骨、安胎，用于治療肝腎不足、腰脊酸疼、足膝痿弱?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[4]表明，杜仲具有抗炎、抗氧化和促進(jìn)骨愈合的作用。續(xù)斷的主要功效是補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏，用于治療肝腎不足、腰膝酸軟、筋傷痹痛等?，F(xiàn)代藥理研究[5]顯示，續(xù)斷具有抗炎、促進(jìn)骨愈合、平衡骨吸收與骨形成速率的作用。杜仲-續(xù)斷配伍使用具有補腎壯骨、通痹止痛的作用[6]。但杜仲-續(xù)斷配伍治療KOA的作用機制尚不明確，因此有必要基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥理學(xué)融合多學(xué)科方法而形成的一種新學(xué)科，能夠全面地反映藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的分子作用機制[7]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，從杜仲、續(xù)斷的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，更加系統(tǒng)深入地挖掘杜仲-續(xù)斷配對調(diào)治KOA的重要靶點和潛在的分子作用機制，以期更好地為治療KOA的臨床用藥提供理論參考，同時為治療KOA的新藥研發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 杜仲-續(xù)斷相關(guān)靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；https://tcmspw.com/tcmsp.php)[8]檢索杜仲、續(xù)斷的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性指數(shù)(drug-likeness，DL)≥0.18[9]對活性成分進(jìn)行初步篩選，以獲取活性化合物，結(jié)合SwissTargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)查找藥物作用的有效蛋白質(zhì)靶點。

1.2 杜仲-續(xù)斷活性的成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 篩選出蛋白質(zhì)靶點后，利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)為化合物作用的蛋白質(zhì)靶點信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用Cytoscape3.8.0[10]構(gòu)建杜仲-續(xù)斷活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，其中“node”表示靶點，“edge”表示兩者之間的關(guān)系。

1.3 KOA相關(guān)靶點篩選 通過檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)[11]、GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://genecards.org)[12]、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)[13]中KOA的潛在靶點，結(jié)合DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)挖掘治療KOA的臨床藥物作用靶點[14]。合并4個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復(fù)值得到KOA的靶點。

1.4 蛋白質(zhì)交互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為明確杜仲-續(xù)斷潛在靶點與KOA相關(guān)靶點之間的相互作用，運用Venny 2.1.0平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將杜仲-續(xù)斷成分靶點與疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖。將共同靶點輸入String 11.0數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，選擇蛋白種類為“Homo sapiens”，最小互相作用值設(shè)置為“medium confidence(0.400)”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 杜仲-續(xù)斷成分-KOA靶點功能與通路的富集分析 David平臺(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)擁有一套全面的功能注釋工具，以了解大量基因背后的生物學(xué)含義。將杜仲-續(xù)斷配對調(diào)治KOA的共同靶點錄入David平臺，獲取生物學(xué)過程和信號通路并進(jìn)行富集分析，將獲得的4個數(shù)據(jù)庫資料根據(jù)count值選用TOP10、TOP20數(shù)據(jù)采用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO富集分析條形圖、KEGG通路富集分析氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 杜仲-續(xù)斷活性成分與靶點的獲取 初步提取杜仲化學(xué)成分147種、續(xù)斷化學(xué)成分31種，經(jīng)ADME篩選和SwissTargetPrediction平臺補充后共獲得杜仲28種、續(xù)斷7種有效活性成分，包括β-谷甾醇(beta-sitosterol)、槲皮素(quercetin)。杜仲有效成分作用靶點489個，續(xù)斷有效成分作用靶點75個，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點243個。利用Cytoscape3.8.0對杜仲-續(xù)斷活性成分及其作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制和分析，共獲得279個節(jié)點與561條關(guān)系，節(jié)點的面積代表Degree值大小，面積越大說明該節(jié)點越重要，結(jié)果見圖1。

注：三角形為藥物有效活性成分，菱形為靶點，面積代表Degree值大小；DZ代表杜仲，XD代表續(xù)斷；A為杜仲、續(xù)斷共有活性成分圖1 杜仲-續(xù)斷活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 KOA相關(guān)靶點的獲取 從GeneCards數(shù)據(jù)庫中共獲得KOA潛在靶點2 070個，相關(guān)性得分(relevance score, RS)越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系更密切。本研究設(shè)定RS大于2倍中位數(shù)的目標(biāo)靶點作為KOA的潛在靶點，在該數(shù)據(jù)庫中KOA靶點RS的中位數(shù)為1.32，故設(shè)定RS>2.64的靶點為KOA的潛在靶點，共1 021個。結(jié)合OMIM、DrugBank、TTD數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，合并4個數(shù)據(jù)庫相關(guān)靶點后刪除重復(fù)值，最終得到1 072個KOA相關(guān)靶點。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選出來的藥物有效活性成分靶點與KOA疾病靶點取交集，得到杜仲-續(xù)斷藥物成分-KOA共同靶點98個。進(jìn)而將共同靶點輸入String平臺，得到杜仲-續(xù)斷藥對-KOA靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 杜仲-續(xù)斷藥對-KOA靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點功能與通路的富集分析 應(yīng)用David數(shù)據(jù)平臺對上述獲取的98個杜仲-續(xù)斷藥對調(diào)治KOA的關(guān)鍵節(jié)點進(jìn)行信號通路分析，借助微生信平臺對結(jié)果進(jìn)行可視化。結(jié)果表明，多個靶點的功能與KOA的發(fā)生密切相關(guān)。杜仲-續(xù)斷藥對主要參與的生物學(xué)過程包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、藥物反應(yīng)(response to drug)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控DNA模板(positive regulation of transcription, DNA-templated)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)等，見圖3中BP。在細(xì)胞組分中，主要作用于細(xì)胞外隙(extracellular space)、細(xì)胞核(nucleus)、細(xì)胞質(zhì)(cytosol)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、胞外區(qū)(extracellular region)等，見圖3中CC。相關(guān)靶點調(diào)節(jié)KOA的功能主要富集于蛋白結(jié)合(protein binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、相同的蛋白結(jié)合(identical protein binding)、蛋白質(zhì)同二聚活動(protein homodimerization activity)、ATP結(jié)合(ATP binding)等，見圖3中MF。將KEGG通路結(jié)果繪制成氣泡圖，氣泡顏色從青到紅代表Lg(P)值由小到大，氣泡面積代表該通路的基因計數(shù)，橫軸代表該通路基因富集數(shù)。KEGG富集通路顯示杜仲-續(xù)斷藥對防治KOA的通路與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路等通路相關(guān)。見圖4。

注：綠色代表生物過程(biological process，BP)，藍(lán)色代表細(xì)胞組成(cellular component，CC)，紅色代表分子功能(molecular function，MF)；Enrichment score代表富集基因數(shù)，數(shù)值越大代表BP、CC、MF越重要圖3 杜仲-續(xù)斷藥對治療KOA的作用靶點富集分析條形圖

注：橫坐標(biāo)為該通路富集的基因數(shù)，氣泡越大、顏色越紅，代表富集程度越顯著圖4 杜仲-續(xù)斷藥對治療KOA的KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

通過分析圖1可以得出，β-谷甾醇、槲皮素等可能是杜仲-續(xù)斷藥對治療KOA的核心有效成分。β-谷甾醇是植物甾醇類，屬于四環(huán)三萜類化合物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化和調(diào)節(jié)骨代謝平衡的作用[15]。有研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能明顯抑制TNF-ɑ、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)的水平起到抗炎作用，從而減輕關(guān)節(jié)炎的癥狀，同時還具有促進(jìn)成骨和抑制破骨作用,達(dá)到骨保護的效果[16]。槲皮素是一種類黃酮化合物，存在于許多植物類藥材中。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[17]表明，槲皮素具有抗炎、抗氧化的作用，通過降低TNF-ɑ、IL-6、CRP的含量從而具有治療關(guān)節(jié)炎的作用，通過降低軟骨變性和膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡從而起到保護關(guān)節(jié)的作用。此外，槲皮素可以通過MAPK信號通路恢復(fù)成骨細(xì)胞功能，進(jìn)而起到骨保護的作用[18]。KOA的臨床疼痛癥狀多由局部炎癥反應(yīng)所致，杜仲-續(xù)斷藥對中活性物質(zhì)β-谷甾醇、槲皮素在炎癥反應(yīng)中都具有獨特的生物抗炎特性，符合KOA的治療原則。

從本次PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果得到較為重要的靶點有MAPK1、TNF等。MAPK1屬于MAPK家族成員，可被炎癥因子激活，參與細(xì)胞增殖、分化的調(diào)節(jié)。有研究[19]表明，MAPK的高表達(dá)與軟骨的降解密切相關(guān)，同時在保護關(guān)節(jié)被破壞方面具有極其重要的作用。TNF是由巨噬細(xì)胞分泌，能夠激活細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。病理研究[20]表明，在KOA的發(fā)病過程中，TNF是關(guān)鍵的炎癥遞質(zhì)，密切參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。同時有研究顯示，TNF與KOA軟骨變性相關(guān)，能夠延緩軟骨變性和KOA發(fā)展的作用[21]。可見，杜仲-續(xù)斷藥對可通過減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和KOA靶點蛋白表達(dá)，從而緩解KOA的進(jìn)程。

KOA發(fā)病首先侵犯關(guān)節(jié)軟骨，參與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、分化的信號通路對于治療KOA至關(guān)重要。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，杜仲-續(xù)斷藥對治療KOA涉及的信號通路有TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路。①TNF信號通路。Bonaventura等[22]研究發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)血管增生、滑膜增殖。②PI3K-Akt信號通路。該通路屬于調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典通路，參與調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的平衡[23]，已被證實與血管修復(fù)再生、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化密切相關(guān)[24]。相關(guān)研究[25]表明，PI3K-Akt信號通路在KOA患者中被抑制，該通路能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的自噬與凋亡，減少軟骨細(xì)胞丟失率和減輕炎癥反應(yīng)，從而緩解KOA的癥狀。③MAPK信號通路。該通路屬于骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的重要信號傳導(dǎo)通路，能夠影響成骨細(xì)胞的分化和凋亡[26]，同時有研究[27]證明該通路在改善KOA癥狀方面發(fā)揮重要作用。重要靶點富集出眾多信號通路，可見杜仲-續(xù)斷對于KOA的復(fù)雜調(diào)控過程，以上所討論通路是重要靶點作用的主要通路，均與軟骨細(xì)胞密切相關(guān)，可能在調(diào)控KOA的過程中起到關(guān)鍵作用。

綜上，杜仲-續(xù)斷藥對調(diào)治KOA的主要成分可能是β-谷甾醇、槲皮素作用于MAPK1、TNF靶點，涉及的通路有TNF、PI3K-Akt、MAPK通路等，與炎癥反應(yīng)、自噬、血管生成、骨代謝等多個生物學(xué)過程息息相關(guān)。由此可知，杜仲、續(xù)斷相須的配伍使用并不是簡單的相同成分含量的增加，而是通過相關(guān)信號通路形成互補作用。本研究結(jié)果可為臨床治療KOA的用藥提供一定的理論參考，同時能夠為新藥的研發(fā)提供新思路。