姜富祥，阿爾賓，高 飛，王 興

（內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市醫(yī)院脊柱外科，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000)

骨肉瘤（osteoma cells）是一種來(lái)源于骨骼的原發(fā)惡性腫瘤，好發(fā)于10 ～20 歲青少年，該年齡段是人體生長(zhǎng)發(fā)育最快階段，若骨細(xì)胞發(fā)生惡性突變，形成惡性骨肉瘤，會(huì)嚴(yán)重威脅青少年健康成長(zhǎng)，但關(guān)于骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制尚不明確，仍缺乏病因治療[1-2]。因此，尋找在骨肉瘤發(fā)病過(guò)程中具有調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵基因，并深入探討其調(diào)控機(jī)制，可以為骨肉瘤的后期治療提供新方向。微小核糖核酸（microRNA, miR）-21 作為具有調(diào)控作用的非編碼微小RNA，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與了腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段[3]。有研究報(bào)道，miR-21 在肺癌中具有致癌活性，其高表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌的總生存期有負(fù)面影響，并且可以預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率和生存率，可作為判斷肺癌疾病進(jìn)展的分子預(yù)后標(biāo)志物[4]。另有研究報(bào)道，miR-21 在胃癌、腎細(xì)胞癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均作為促癌因子，抑制miR-21 表達(dá)，則對(duì)患者體內(nèi)癌細(xì)胞的增殖及侵襲起到一定的抑制作用，這可能為惡性腫瘤的治療提供新的潛在策略[5-7]。此外，還有研究證實(shí)miR-21 在骨肉瘤組織中高表達(dá)，且與病理分期、腫瘤等級(jí)及肺轉(zhuǎn)移等臨床病理有關(guān)，但關(guān)于miR-21 作用骨肉瘤的調(diào)控機(jī)制卻鮮有報(bào)道[8]。因此，本研究著重分析miR-21 在人骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及抑制miR-21 表達(dá)后對(duì)骨肉瘤MG-63 細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響，進(jìn)而深入探討miR-21 在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞株來(lái)源 人正常骨細(xì)胞hFOB1.19，人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，U2OS 和Saos-2 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 儀器與試劑 胎牛血清，DMEM 培養(yǎng)液（鄭州九龍生物制品有限公司）； RNA 試劑盒，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]；CKK-8 試劑盒（上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司）；PTEN，PI3K，AKT，p-AKT 多克隆抗體（北京艾柏森生物科技有限公司）；LipofectAMINE 2000 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒（杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；Transwell 小室（北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder 公司）；熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將hFOB1.19，MG-63，U2OS 和Saos-2 細(xì)胞接種于含10g/dl 胎牛血清，100 U/ml 青霉素和鏈霉素混合液配置的DMEM 培養(yǎng)液，放置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度為80%時(shí)，用胰蛋白酶消化、傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)各細(xì)胞中miR-21 的表達(dá)：依照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞進(jìn)行總RNA 提取，取少量純度高的RNA 加入提前滅菌的無(wú)酶離心管，再依次加入RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的相關(guān)試劑，通過(guò)酶促反應(yīng)合成第一鏈cDNA；用上述合成的第一鏈cDNA 作為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μl，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 15 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)35 次；所有操作完成后即可通過(guò)PCR 儀檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-21 表達(dá)量，其相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。PCR 引物序列：miR-21：上游5’-GTCGAGCGTCGCACGT-3’，下游5’-GCCGGTAC GTTATCACAGTGT-3’；內(nèi)參U6：上游5’-CTAAC TGATACTGCGCTAGCA-3’，下游5’-TGCGACCG ACGACAATGAA-3’。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63 細(xì)胞接種于24 孔板，待細(xì)胞渾濁度為90%～95%時(shí)，將其隨機(jī)分為三組，即Control 組，miR-21-NC 組及miR-21-inhibitor 組，在每組細(xì)胞培養(yǎng)板中加入提前混合均勻的LipofectAMINE 2000 試劑和DNA 稀釋液，并輕輕搖動(dòng)使細(xì)胞與混合液充分融合，轉(zhuǎn)染4 ～6 h 后將細(xì)胞以1∶10 比例轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后通過(guò)qRT-PCR 法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.3.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取上述轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化后接種于96 孔板中，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24，48，72，96 h，取出后每孔加20 μl CKK-8 溶液，盡量避免產(chǎn)生氣泡，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育1 ～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（A），吸光度值越大則細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.3.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：分別取上述轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，經(jīng)消化、離心后收集全部細(xì)胞至1.5 ml 離心管，用提前預(yù)冷的PBS 洗滌兩次，然后加入1×結(jié)合緩沖液1 ml 重懸細(xì)胞。取100μl 細(xì)胞重懸液加入5 ml 培養(yǎng)管中，加入5μl FITC 標(biāo)記的Annexin-V 和5μl PI 染液，混勻后室溫避光孵育15 min，然后再加入 400μl 的1×結(jié)合緩沖液，整個(gè)操作過(guò)程不能用力吹打細(xì)胞，反應(yīng)完畢后應(yīng)在1h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，用FL1 通道檢測(cè)FITC-Annexin V 熒光，用FL2 通道檢測(cè)PI 熒光。

1.3.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：用50 mg/L Matrigel 1∶8 稀釋液包被Transwell 小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。取上述轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，終止消化后用PBS 潤(rùn)洗1 ～2 遍，用含BSA 的無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105，取200μl 細(xì)胞重懸液接種于放有Transwell 小室的24 孔板中，在24 孔板下室加入500μl 含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)液，若下層培養(yǎng)液與小室之間出現(xiàn)氣泡，則需將小室提起，去除氣泡后再放進(jìn)培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h，取出Transwell 小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，下層細(xì)胞經(jīng)PBS清洗和酒精固定后，用0.1g/dl 結(jié)晶紫染色20 min，PBS 清洗2 次，倒置晾干后即可在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照。

1.3.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn)：分別取上述轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，置于冰上，加入1ml PBS 重懸后，4 ℃離心5 min，除去細(xì)胞中殘留的微量血清，然后加入IP 細(xì)胞裂解液輕輕重懸細(xì)胞，在 4℃，13 000 r/min 的條件下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml 離心管，取5μl 進(jìn)行蛋白定量，將所有蛋白濃度調(diào)整為統(tǒng)一大小后，100 ℃ 加熱5 min，以充分變性蛋白。然后在提前準(zhǔn)備好的電泳槽中開始上樣，每孔上樣量為10μl，上樣完畢后蓋好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)電壓進(jìn)行電泳，上層濃縮膠電壓為80 V，下層分離膠電壓為110 V，待溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端3cm 處停止電泳。按照陰極碳板、海綿、三濾紙、膠、膜、三濾紙、海綿、陽(yáng)極碳板的順序進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA，60min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后把蛋白膜放入Western 洗滌液漂洗3 min，5g/dl 脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入提前稀釋好的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，回收一抗，洗膜液漂洗3 次后加入二抗，搖床孵育1 h，回收二抗，洗膜液漂洗3 次后根據(jù)顯影定影試劑說(shuō)明進(jìn)行洗片，常溫晾干后將膠片置于凝膠成像儀觀察拍照，并用Image-J 軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人正常骨細(xì)胞和人骨肉瘤細(xì)胞系中miR-21 表達(dá)水平比較 qRT-PCR 結(jié)果表明，人骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2，U2OS 和MG-63 中miR-21 的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.29±0.14，1.75±0.21，2.12±0.25，較人正常骨細(xì)胞hFOB 1.19 中miR-21 表達(dá)水平（0.75±0.12）顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=38.037，P=0.002）。

2.2 MG-63 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證 qRT-PCR 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Control 組miR-21 表達(dá)水平為2.07±0.28，miR-21-NC 組其表達(dá)水平為2.02±0.33，miR-21-inhibitor 組 miR-21 表達(dá)水平（1.07±0.15）較以上兩組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.357，P=0.005），說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

2.3 抑制miR-21 表達(dá)對(duì)MG-63 細(xì)胞增殖能力的影響 見表1。CKK-8 結(jié)果表明，與Control 組和miR-21-NC 組相比，miR-21-inhibitor 組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)A值均顯著下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=71.409 ～378.281，均P＜0.001），說(shuō)明抑制miR-21 表達(dá)可抑制MG-63 細(xì)胞增殖。

2.4 抑制 miR-21 表達(dá)對(duì)MG-63 細(xì)胞凋亡能力的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，Control 組MG-63細(xì)胞凋亡數(shù)為8.65%，miR-21-NC 組細(xì)胞凋亡數(shù)為10.60%，抑制 miR-21 表達(dá)后，其凋亡數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的45.0%，較Control組和miR-21-NC組顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.134，P＜0.001）。

2.5 抑制 miR-21 表達(dá)對(duì)MG-63 細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明，miR-21-inhibitor 組細(xì)胞穿膜數(shù)為102±9 個(gè)，較Control 組細(xì)胞穿膜數(shù)（189±12 個(gè)）及miR-21-NC 組細(xì)胞穿膜數(shù)（177±16 個(gè)）明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=158.781，P＜0.001），說(shuō)明抑制miR-21 表達(dá)可以抑制MG-63 細(xì)胞的侵襲。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞吸光值（A）比較（± s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞吸光值（A）比較（± s）

注：24，48，72，96h ③組 vs ①組，t=9.013，15.936，23.186，10.753，均P＜0.001; ③組 vs ②組，t=8.343，14.500，21.321，9.847，均P＜0.001。

時(shí)間（h）Control①miR-21-NC 組②miR-21-inhibitor 組③FP 240.214±0.0170.205±0.0210.093±0.00971.409＜0.001 480.452±0.0230.431±0.0170.219±0.012168.511＜0.001 720.874±0.0260.842±0.0280.476±0.019257.545＜0.001 961.014±0.0310.992±0.0270.753±0.031378.281＜0.001

2.6 抑制 miR-21 表達(dá)對(duì)MG-63 細(xì)胞中PTEN，PI3K，AKT 及p-AKT 蛋白表達(dá)的影響 見表2。Western blot 結(jié)果表明，與Control 組和miR-21-NC 組相比，miR-21-inhibitor 組PTEN 蛋白表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=102.781，P＜0.001），PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.309，P＜0.001；F=138.615，P＜0.001），但抑制miR-21 表達(dá)對(duì)AKT 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.527，P=0.152）。

表2 抑制miR-21 表達(dá)對(duì)各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響（± s）

表2 抑制miR-21 表達(dá)對(duì)各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響（± s）

項(xiàng) 目ControlmiR-21-NC 組miR-21-inhibitor 組FP PTEN0.61±0.0170.65±0.0211.12±0.009102.781＜0.001 PI3K0.75±0.0230.72±0.0170.41±0.01286.309＜0.001 AKT0.92±0.0260.89±0.0280.90±0.01914.5270.152 p-AKT1.01±0.0310.99±0.0270.54±0.031138.615＜0.001

3 討論

由于骨肉瘤早期癥狀與普通的關(guān)節(jié)疼痛相似，不易被重視，且骨肉瘤侵襲能力強(qiáng)，在早期極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致術(shù)后5年生存率較低，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[9]。因此，急需尋找新的治療方法和靶向藥物來(lái)進(jìn)一步提高骨肉瘤患者的生存率，改善其不良預(yù)后。miR-21 屬于原癌基因，幾乎所有的癌癥都有參與，主要包括細(xì)胞分化、基因調(diào)控、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)行為[10]。趙琦等[11]研究表明，與對(duì)照組相比，miR-21在肺癌患者血漿表達(dá)水平明顯升高，且其表達(dá)水平與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及化療療效相關(guān)。ZHANG 等[12]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21 高表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)PDCD4基因來(lái)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的激活，顯著增加MMP-3，MMP-9，PDGF 和CCL-7 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細(xì)胞系的侵襲及增加了PDAC 的耐藥性，說(shuō)明miR-21 是激活與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)劑。此外，大量研究顯示，miR-21 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤中作為促癌因子，與癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等密切相關(guān)[13-14]。關(guān)于miR-21 對(duì)骨肉瘤的影響也有部分報(bào)道，但其作用機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步的驗(yàn)證[15]。

PI3K/AKT 通路廣泛存在于細(xì)胞中，與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)，其異常激活不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及分化等，PTEN 作為miR-21 的靶向調(diào)控因子，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT 途徑影響到腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡，對(duì)癌癥的發(fā)生發(fā)展起到重要作用[16-17]。WU 等[18]發(fā)現(xiàn)miR-21 在食道癌組織中高表達(dá)，抑制miR-21 表達(dá)，可降低癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移活性，并且miR-21 低表達(dá)可以負(fù)向調(diào)控靶基因PTEN 的表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/AKT 活化，為食管癌的臨床治療提供了新方法。ZHAO 等[19]研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可以誘導(dǎo)TCP-1 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，其作用機(jī)制可能與miR-21/ PTEN/ Akt 途徑有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚在體外通過(guò)miR-21/PTEN/AKT 途徑抑制肺癌A549 細(xì)胞的生長(zhǎng)；在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，這可能是一種更特異、更有效治療肺癌的新方法[20]。

本研究首先采用qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞系中miR-21 表達(dá)水平顯著高于正常骨細(xì)胞，因此可以推斷miR-21 與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是一種促癌基因；此外還能觀察到miR-21 在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)最為顯著，因此，選擇該細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染抑制劑能顯著降低MG-63細(xì)胞中miR-21 的表達(dá)，說(shuō)明利用脂質(zhì)體2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是穩(wěn)定可行的；CKK-8 實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾miR-21 表達(dá)可以降低MG-63 細(xì)胞的增殖和侵襲能力。流式結(jié)果顯示，Control 組和miR-21-NC 組MG-63 細(xì)胞膜保持完好，活細(xì)胞比例較高，只出現(xiàn)了少量壞死和早期凋亡。miR-21-inhibitor 組MG-63 正常細(xì)胞比例顯著降低，而晚期細(xì)胞凋亡比例顯著升高，推測(cè)其原因可能是通過(guò)RNA 干擾技術(shù)抑制miR-21 表達(dá)，則可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞從正常期向凋亡期轉(zhuǎn)變，加快其凋亡進(jìn)程。同時(shí)本研究經(jīng)Westernblot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21 表達(dá)后PTEN 蛋白表達(dá)上調(diào)，預(yù)測(cè)PTEN 在骨肉瘤中亦可作為miR-21 的靶向結(jié)合位點(diǎn)；另PI3K 和磷酸化AKT 水平下調(diào)，對(duì)AKT 表達(dá)無(wú)顯著影響，提示miR-21 抑制MG-63 細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)凋亡可能與激活PTEN/PI3K/AKT 通路有關(guān)。

綜上所述，miR-21 作為促癌因子在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且能通過(guò)抑制miR-21 表達(dá)來(lái)激活PTEN/AKT/mTOR 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。但本研究還存在一定的局限性，首先只做了體外實(shí)驗(yàn)，miR-21 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的表達(dá)水平及調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證；其次miR-21 是否還能通過(guò)其他途徑來(lái)調(diào)控骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展還需進(jìn)行深入研究。