劉 偉,周 楊,邊 超,東 麗

（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院a.放射治療科；b.腫瘤內(nèi)科, 呼和浩特 010010）

食管癌是中國(guó)第六大常見(jiàn)癌癥，也是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因，2018年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球有超過(guò)57 萬(wàn)例新診斷食管癌病例和51 萬(wàn)左右食管癌死亡病例[1]。盡管食管癌的診斷技術(shù)和治療取得了進(jìn)步，但是食管癌患者的總體生存率仍然很差[2]。食管癌患者對(duì)化療和放療敏感度降低是患者病情進(jìn)展導(dǎo)致預(yù)后不良的重要原因[3]，而食管癌化療和放療抵抗的分子機(jī)制尚未完全明確，因此迫切需要進(jìn)行探討，以尋找新的治療手段改善患者療效。研究報(bào)道微小核糖核酸（microRNA, miRNA）密切參與腫瘤的惡性進(jìn)展，包括增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤的化療和放療抵抗[4]。MiR-495 是腫瘤抑制因子，在子宮內(nèi)膜癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]，在非小細(xì)胞肺癌和胃癌中與腫瘤耐藥相關(guān)[7]，并且研究報(bào)道m(xù)iR-495 抑制食管癌的增殖[8]，但是miR-495 與食管癌化療和放療敏感度的關(guān)系未見(jiàn)有報(bào)道。基于順鉑的化療方案是治療食管癌的一線藥物，也常常引起患者耐藥[9]，因此本文對(duì)miR-495 在食管癌細(xì)胞順鉑和放射敏感度中的作用及機(jī)制進(jìn)行了探討，以期發(fā)現(xiàn)miR-495增加食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑和放射治療敏感度的作用及機(jī)制，以及作為逆轉(zhuǎn)食管癌化療和放療抵抗候選靶點(diǎn)的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 食管癌細(xì)胞系Eca109，購(gòu)于中國(guó)上?？茖W(xué)院, 快速?gòu)?fù)蘇后重懸至含有10g/dl 胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，放置在37℃，5ml/dl CO2的全濕度培養(yǎng)箱中。隔天更換新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)至95%左右時(shí)，一比三進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2 儀器與試劑 基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone 公司）；miR-495 mimic（中國(guó)上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司）；Trizol 試劑（日本TaKaRa 公司）；OneStep RT-PCR Kit 試劑盒、RIPA和熒光素酶報(bào)道基因試劑盒（北京索萊寶試劑公司）；miR-495 和GAPDH 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CCK8 試劑（美國(guó)GlpBio 公司）；BCA 檢測(cè)蛋白濃度試劑盒（美國(guó)Thermo 公司）；Bcl-2，Bax 和caspase 3 抗體（美國(guó)proteintech 公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)millipore 公司）。

1.3 方法

1.3.1 Eca109-RAD 及Eca109-DDP 的構(gòu)建：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109 細(xì)胞1×105個(gè)接種至6 孔板中，進(jìn)行分次遞增放射，1，2，4 和8Gy 劑量各輻射3次，總量為45 Gy。輻射后敏感性細(xì)胞死去，存活的放射抵抗細(xì)胞形成細(xì)胞克隆，獲得的放射抵抗細(xì)胞（Eca109-RAD）可在4 Gy 放射劑量下生長(zhǎng)。Eca109-RAD 擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109 細(xì)胞1×105個(gè)接種至6 孔板中，以0.1，0.2，0.4 和0.8ng/ml 順鉑分次處理誘導(dǎo)，順鉑敏感的細(xì)胞死去，具有耐藥性的細(xì)胞形成細(xì)胞克隆，獲得順鉑耐藥的細(xì)胞（Eca109-DDP）可在0.4ng/ml 濃度下生長(zhǎng)。將Eca109-DDP 擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109-RAD 細(xì)胞或Eca109-DDP 細(xì)胞1×105個(gè)接種至6 孔板中，分為NC 組和miR-495 mimic 組，12h 后采用脂質(zhì)體2000 進(jìn)行各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，10h 后更換新鮮完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.3 qRT-PCR 細(xì)胞：經(jīng)Trizol 試劑裂解后加入氯仿，低溫高速離心后獲取上層上清液，加入異丙醇和無(wú)水乙醇試劑獲取細(xì)胞中總RNA，根據(jù)OneStep RT-PCR Ki 試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，25×One Step 1μl，RTase mix 5×One Step RT Mix Buffer 5μl，Primer (1)2.5μl，Primer (2)2.5μl，RNA 0.5μg和雙蒸水補(bǔ)足25μl。以反轉(zhuǎn)錄 50℃ 20min，變性95℃ 3min（變性95℃ 15 s，退火延伸60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s）40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，miR-495 引物F：5’-TCCGATTCTTCACGTGGTAC-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6引物F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，R：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。按照2-ΔΔCt公式計(jì)算，以U6 為內(nèi)參計(jì)算miR-495 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 CCK8 檢測(cè)放射敏感度：轉(zhuǎn)染的NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-RAD 細(xì)胞或Eca109-DDP細(xì)胞以每孔3 000 個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板中，每組包含6 個(gè)復(fù)孔，接種12h 后分別采用不同放射劑量（0，1，2，4，8，16，32 和64 Gy）照射Eca109-RAD細(xì)胞各組細(xì)胞、不同濃度的順鉑（0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 和3.2μg/ml）處理Eca109-DDP 細(xì)胞，放置于37℃，5ml/dl CO2的全濕度培養(yǎng)箱中48h，加入10μl 的CCK8 試劑，孵育1h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)孔的490nm 吸光度值（A）。細(xì)胞存活率=(處理組平均A值/不處理組平均A值)×100%。

1.3.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成率：各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以500 個(gè)細(xì)胞接種至6 孔板中，每組包含3 個(gè)重復(fù)孔，NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-RAD 細(xì)胞以4Gy 的放射劑量進(jìn)行輻射，NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-DDP 細(xì)胞以0.4ng/ml 放射劑量進(jìn)行輻射。各組細(xì)胞放置于37℃，5ml/dl CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 天左右，細(xì)胞克隆團(tuán)形成。終止培養(yǎng)，PBS 洗兩次，甲醇溶液固定10min，吉姆薩染液染色10min，晾干后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)目，細(xì)胞克隆形成率=(miR-495 mimic 組平均克隆團(tuán)數(shù)目/NC 組平均克隆團(tuán)數(shù)目)×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以500 個(gè)細(xì)胞接種至6 孔板中，每組包含3個(gè)重復(fù)孔，NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-RAD細(xì)胞以4Gy 的放射劑量進(jìn)行輻射，NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-DDP 細(xì)胞以0.4ng/ml 放射劑量進(jìn)行輻射。各組細(xì)胞放置于37℃，5ml/dl CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。終止培養(yǎng)，經(jīng)胰酶消化后按照Annexin V-FITC/PI 染色試劑盒依次加入染色緩沖液500μl，Annexin V-FITC 5μl 和PI 5μl混勻后常溫放置10min 后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.7 Western blotting：增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光法。細(xì)胞經(jīng)RIPA 裂解后，14 000r/min 離心30min，獲得上清細(xì)胞總蛋白。采用BCA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度，沸水中煮5min 蛋白變性，上樣進(jìn)行凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白（80V，2h），電濕轉(zhuǎn)（350mA，2h）將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。8%封閉液室溫封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（enhanced chemiluminescence, ECL）加至PVDF 膜上，顯影液和定影液曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用軟件SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR 檢測(cè)Eca109-RAD 和Eca109-DDP 細(xì)胞中miR-495 的表達(dá) qRT-PCR 檢測(cè)顯示miR-495在Eca109，Eca109-RAD 細(xì)胞和Eca109-DDP 細(xì)胞中的表達(dá)分別為0.99±0.01，0.48±0.03 和0.52±0.05，與Eca109 細(xì)胞相比，Eca109-RAD 細(xì)胞和Eca109-DDP 細(xì)胞中miR-495 的表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.930, 15.970, 均P=0.000)。

2.2 qRT-PCR 檢測(cè)miR-495 mimic 轉(zhuǎn)染效果 qRTPCR 檢測(cè)miR-495 mimic 轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞Eca109-RAD 和Eca109-DDP 的過(guò)表達(dá)效果，結(jié)果顯示miR-495 在NC 組Eca109-RAD 細(xì)胞、miR-495 mimic 組Eca109-RAD 細(xì)胞、NC 組Eca109-DDP 細(xì)胞、miR-495 mimic 組Eca109-DDP 細(xì)胞中miR-495 的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.03，4.82±0.48，1.00±0.01，5.68±0.54。在Eca109-RAD 和Eca109-DDP 細(xì)胞中與NC 組相比，miR-495 mimic 組中miR-495 相對(duì)表達(dá)量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.760,15.100,均P=0.000)。表明miR-495 mimic 成功轉(zhuǎn)染至Eca109-RAD 和Eca109-DDP 細(xì)胞中，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 miR-495 對(duì)食管癌細(xì)胞放射和順鉑敏感度的影響 見(jiàn)表1。NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-RAD 細(xì)胞經(jīng)不同放射劑量照射48h，CCK8 結(jié)果顯示在相同放射劑量作用下，miR-495 mimic 組Eca109-RAD 細(xì)胞存活率顯著低于NC 組，表明miR-495 mimic增加Eca109-RAD細(xì)胞放射敏感度。NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-DDP 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的順鉑處理48h，CCK8 結(jié)果顯示在相同濃度順鉑作用下，miR-495 mimic 組Eca109-DDP 細(xì)胞存活率顯著低于NC 組，表明miR-495 mimic 增加Eca109-DDP 細(xì)胞順鉑敏感度。

2.4 miR-495 對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成能力的影響miR-495 mimic 轉(zhuǎn)染Eca109-RAD 和Eca109-DDP后，平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC 組細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為93.33±4.51 個(gè)，89.00±4.03 個(gè)，miR-495 mimic 組細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為46.33±5.69個(gè)，34.67±2.52 個(gè)，與NC 組相比，miR-495 mimic組Eca109-RAD 和Eca109-DDP 細(xì)胞平板克隆形成能力均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.210,19.800,均P=0.000）。

表1 miR-495 對(duì)食管癌細(xì)胞放射和順鉑敏感度的影響（±s）

表1 miR-495 對(duì)食管癌細(xì)胞放射和順鉑敏感度的影響（±s）

放射劑（Gy）Eca109-RADDDP 濃度（μg/ml）Eca109-DDP NC 組miR-495mimic 組t 值P 值NC 組miR-495mimic 組t 值P 值0100.00±0.00100.00±0.010100.00±0.02100.00±0.00 199.20±2.1192.00±3.057.7600.0010.0599.21±1.2391.54±2.187.5100.000 298.06±3.0778.12±2.6712.0100.0000.195.04±2.1580.41±3.099.5200.000 493.30±3.8454.54±4.5915.8700.0000.292.33±2.2063.83±4.2414.6200.000 865.10±2.9936.24±2.2618.8600.0000.476.10±3.2741.59±2.1421.6300.000 1648.50±3.4825.41±3.1712.0200.0000.849.25±3.3123.23±1.1918.1200.000 3221.30±2.0414.24±1.536.7800.0001.622.67±2.2412.56±1.129.8900.000 6410.20±1.574.26±1.047.7300.0003.214.31±1.098.67±1.079.0500.000

miR-495 mimic 轉(zhuǎn)染Eca109-RAD 和Eca109-DDP 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示NC 組細(xì)胞凋亡率分別為（8.39±0.82）%，（8.67±1.15）%，miR-495 mimic 組 細(xì) 胞 凋 亡 率 分 別 為（25.66±2.41）%，（21.05±5.37）%，與NC 組相比，miR-495 mimic 組Eca109-RAD 和Eca109-DDP 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.750, 10.030，P=0.000，0.001）。

2.5 miR-495 對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2。Western blotting 結(jié)果顯示Eca109-RAD 細(xì)胞經(jīng)輻射、Eca109-DDP 細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后，與NC 組相比，miR-495 mimic 組Eca109-RAD 和Eca109-DDP 細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)均降低，Bax 和caspase 3 蛋白的表達(dá)均增加(P＜0.05) 。

表2 Western blotting 檢測(cè)miR-495 對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 Western blotting 檢測(cè)miR-495 對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

項(xiàng) 目Eca109-RADEca109-DDP NC 組miR-495mimi 組t 值P 值NC 組miR-495mimic 組t 值P 值Bcl-21.09±0.060.91±0.034.6500.0060.89±0.050.52±0.077.4500.001 Bax0.73±0.082.06±0.1414.2900.0000.28±0.041.03±0.1012.0600.000 caspase 30.32±0.050.83±0.0710.2700.0000.44±0.060.85±0.087.1000.001

3 討論

食管癌是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)高死亡率和預(yù)后差的最常見(jiàn)惡性消化系統(tǒng)腫瘤之一，嚴(yán)重威脅患者的生命健康和降低患者的生存質(zhì)量[1]。根據(jù)組織病理學(xué)食管癌分為兩種亞型：食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌，其中食管鱗狀細(xì)胞癌是最主要和最普遍的組織學(xué)亞型，在中國(guó)食管癌病例中食管鱗狀細(xì)胞癌占90%以上[10]。早期食管癌的治療主要是手術(shù)切除，但是由于患者早期缺乏特異的臨床癥狀，食管癌患者往往被診斷為晚期，晚期患者由于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和周圍組織器官浸潤(rùn)，無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除，因此化學(xué)治療和放射治療是晚期患者的主要治療手段，但是大部分患者出現(xiàn)化療和放療抵抗，導(dǎo)致患者5年生存率較低，不足30%[2]。因此研究食管癌化療和放療敏感度相關(guān)的分子機(jī)制，對(duì)探索治療靶點(diǎn)，改善食管癌患者預(yù)后具有重要意義。

miRNA 屬于長(zhǎng)度為19 ～24 個(gè)核苷酸的小非編碼RNA，不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，可以通過(guò)與靶mRNA 的互補(bǔ)結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因，在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、發(fā)育和運(yùn)動(dòng)等幾乎所有的生理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[11]。研究報(bào)道m(xù)iRNA 表達(dá)異常導(dǎo)致疾病的發(fā)生，其中人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[4]，是目前的研究熱點(diǎn)。人類14q32.31 基因簇位于基因組的印跡區(qū)域，包含許多編碼miRNA 的基因，參與促進(jìn)正常組織的發(fā)育并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和化學(xué)敏感性[12]。miR-495 是14q32.31 miRNA 簇的成員，是正常胰腺發(fā)育的重要因子，其與miRNA let-7b 一起誘導(dǎo)分化，通過(guò)抑制肝細(xì)胞核因子6 來(lái)防止胰腺腺泡細(xì)胞的化生，同時(shí) miR-495 與14q32.31 簇中的其他miRNA 一樣，密切參與腫瘤的進(jìn)展[13]。miR-495在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，并顯著抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白[6]。同時(shí)miR-495 在食管癌中也有研究報(bào)道，MAO 等[8]報(bào)道在食管癌組織中miR-495 的表達(dá)降低，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲、TNM 分期增加和患者預(yù)后不良相關(guān)，miR-495 的過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，表明miR-495 在食管癌中是具有重要功能的分子。在非小細(xì)胞肺癌中miR495-UBE2C-ABCG2/ERCC1 軸通過(guò)下調(diào)抗藥基因和減少順鉑抗性逆轉(zhuǎn)順鉑的抗性，以及miR-495 低表達(dá)與胃癌多藥耐藥性相關(guān)[7]，表明miR-495 與腫瘤的耐藥相關(guān)，但是miR-495 在食管癌耐藥方面的相關(guān)報(bào)道未知，miR-495 是否與食管癌包括腫瘤化療和放療的治療抵抗相關(guān)，引起我們的關(guān)注。

本文首先誘導(dǎo)建立了放療抵抗食管癌細(xì)胞Eca109-RAD 及順鉑耐藥食管癌細(xì)胞Eca109-DDP，qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-495 在Eca109-RAD 及Eca 109-DDP 細(xì)胞中表達(dá)降低，提示miR-495 與食管癌放療抵抗和化療耐藥相關(guān)。以及miR-495 mimic 轉(zhuǎn)染Eca109-RAD 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)miR-495 增加食管癌細(xì)胞對(duì)放療敏感度，以及經(jīng)4 Gy 劑量照射NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-RAD 細(xì)胞后，miR-495 mimic 組細(xì)胞增殖和平板克隆形成能力降低，細(xì)胞凋亡增多，表明miR-495 與食管癌放療敏感性相關(guān)。CHEN 等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-495 通過(guò)抑制耐藥相關(guān)基因ABCG2 和ERCC1 逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞順鉑的耐藥。順鉑是廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的化學(xué)藥物，具有廣譜性，在食管癌患者的化療治療中處于一線藥物地位，但食管癌細(xì)胞對(duì)其常常產(chǎn)生抵抗性，導(dǎo)致患者治療效果不佳[9]，因此本文研究了miR-495 在食管癌細(xì)胞順鉑耐藥方面的作用。首先miR-495 mimic 轉(zhuǎn)染Eca109 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)miR-495 增加食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑作用的敏感度，經(jīng)0.4 ng/ml 濃度處理NC 組和miR-495 mimic 組Eca109-DDP 細(xì)胞后，miR-495 mimic 組細(xì)胞增殖和平板克隆形成能力降低，細(xì)胞凋亡增多，表明miR-495 與食管癌化療耐藥相關(guān)。同時(shí)結(jié)果表明miR-495 增加食管癌細(xì)胞對(duì)放射和順鉑敏感性可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用，而細(xì)胞凋亡的發(fā)生是在細(xì)胞凋亡蛋白的調(diào)控作用下發(fā)生的，因此本文采用Western blotting 檢測(cè)了相關(guān)凋亡蛋白的變化，其中Bcl-2 基因是經(jīng)典的抗凋亡基因，和促凋亡基因Bax 均屬于Bcl-2 家族，Bcl-2蛋白的活性可被Bax調(diào)控，兩者在腫瘤的放療、化療和靶向治療等治療作用中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[14]，在已有的報(bào)道中兩者與食管癌的化療和放療敏感性中均具有重要作用[15]。在凋亡信號(hào)刺激的作用下，Bax 蛋白表達(dá)升高，導(dǎo)致線粒體膜的通透性增加，促使凋亡蛋白caspase 3 的激活，caspase 3蛋白的激活是凋亡發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的重要標(biāo)志[16]。本文發(fā)現(xiàn)在Eca109-RAD 細(xì)胞和Eca109-DDP 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-495，并在放射線和DDP 的作用下，細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax和caspase 3 的表達(dá)增加，表明miR-495 通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡在食管癌放療和化療中發(fā)揮增敏作用。

綜上所述，miR-495 促進(jìn)食管癌細(xì)胞化療和放療的敏感性，其作用機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控凋亡蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用，miR-495 可能是逆轉(zhuǎn)食管癌化療和放療抵抗性，以及治療食管癌的潛在分子靶點(diǎn)。