胡道軍，史文杰，孫 敏

（1.上海市新華醫(yī)院崇明分院檢驗(yàn)科，上海 202150；2.桂林市中醫(yī)醫(yī)院乳腺外科，廣西桂林 541002；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院太和醫(yī)院普外科，湖北十堰 442000）

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種高度惡性的腫瘤，發(fā)病率和死亡率都在迅速上升，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往被診斷為臨床晚期[1-2]。因此，積極尋求結(jié)直腸癌發(fā)病的調(diào)控基因和治療靶點(diǎn)，提升病人的生存時(shí)間和生活質(zhì)量迫在眉睫。長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（long non-coding RNAs，LncRNAs）是長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，沒有或僅有有限的蛋白質(zhì)編碼功能[3-4]，通過與DNA，RNA 或蛋白質(zhì)的相互作用參與多種致癌過程和疾病發(fā)生[5]。LncRNAs 能通過影響癌癥的功能特征（比如不受控制的增殖、逃避細(xì)胞死亡以及轉(zhuǎn)移形成），或者直接（間接）地通過干擾不同的途徑而發(fā)揮癌基因或腫瘤抑制因子的作用[6-7]。在結(jié)直腸癌中，LncRNAs 還可通過多種調(diào)控方式影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并與結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[8]。SALMENA等[9]于2011年提出競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性核糖核酸（competitive endogenous RNA，ceRNA）假說，認(rèn)為lncRNA，mRNA 或其他的RNA 分子，可以作為天然mRNA“海綿”，通過共同的miRNA 反應(yīng)元件(microRNA response elements，MREs)與miRNA 結(jié)合從而影響miRNA導(dǎo)致的基因沉默。有研究顯示，LncRNA NEAT1 在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中過表達(dá)，參與腫瘤增殖、遷移、凋亡等[11]。我們通過生物信息學(xué)工具成功預(yù)測(cè)LncRNA NEAT1/miR23b-3p/KLF3 分子調(diào)控軸可能通過ceRNA 參與調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生。本研究最終以HT29 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，初步驗(yàn)證該分子軸在結(jié)直腸癌的表達(dá)情況和調(diào)控機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌提供新的策略和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 HT29（人結(jié)直腸癌細(xì)胞株）和HEK293（人胚胎腎293 細(xì)胞，用于雙熒光基因轉(zhuǎn)染）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 儀器與試劑 McCoy’s 5A 完全培養(yǎng)液（凱基生物，貨號(hào)KGM4892S）；CCK-8 法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（凱基生物，貨號(hào)KGA317）；Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit Cell Cycle Staining Kit（聯(lián)科生物）；Trizol 試劑（康為世紀(jì)）；qRT-PCR試劑（生命互聯(lián)）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（ 美國Promega 公司）；KLF3 抗體（Cell Signaling Technology公司），二抗IgG（北京康維公司）。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析：在線工具starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/index.php) 預(yù)測(cè)miRNA 和lnc RNA 之間的互作關(guān)系。利用多個(gè)在線工具（PITA,RNA22, miRmap, microT, miRanda, PicTar 和TargetScan）預(yù)測(cè)miRNA-mRNA 之間的互作關(guān)系。最終預(yù)測(cè)NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 調(diào)控軸為研究對(duì)象。癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫分析NEAT, miR-23b-3p, KLF3 在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平及其相關(guān)性。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：HT29 細(xì)胞均置于含10g/dl 胎牛血清的McCoy’s 5A 培養(yǎng)液，37℃和5ml/dl CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為Control 組、NC 組和si-NEAT1 組（取干擾效果最好的一組）。轉(zhuǎn)染前24h，將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞鋪于6 孔板上，細(xì)胞密度約5×105/孔，待細(xì)胞達(dá)到70%～90%融合時(shí)，按Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書對(duì)HT29 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化、重懸和計(jì)數(shù)，并向96 孔板加入100μl 細(xì)胞懸液（約7 000 個(gè)/孔）；培養(yǎng)24h 后使細(xì)胞貼壁，再加入10μl CCK8 試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2h，450nm 波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀（北京六一生物科技，型號(hào)TD4A）檢測(cè)每孔的吸光值。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：調(diào)整HT29 細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，加1ml PBS 1 500 r/min 離心3 min，洗兩遍。取300μl 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，每管加入3 μl Annexin V-APC 和5μl 7-AAD。輕微混勻后，室溫避光孵育 10 min。再向每管中加入200μl 預(yù)冷的1×Binding Buffer，混勻后流式儀檢測(cè)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：將細(xì)胞懸液1 500 r/min 離心3 min，棄上清。加入1ml PBS,1 500 r/min 離心棄上清，加1 ml DNA Staining solution 和10 μl Permeabilization solution，渦旋振蕩5 ～10s 混勻，室溫避光孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)（NovoCyte 2060R，杭州艾森生物公司）。

1.3.6 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化收集，1 500 r/min 離心10min，細(xì)胞濃度調(diào)至1×105/ml。上室加入100μl 無血清的細(xì)胞懸液，下室（侵襲小室）加入500μl 10g/dl 胎牛血清培養(yǎng)液。隨后放入37 ℃含5ml/dl CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS 洗滌3 次。室溫下，小室放在95%乙醇中固定5 min；0.5g/dl 結(jié)晶紫染色10 min，PBS 漂洗，用棉簽輕輕拭去小室濾膜上層細(xì)胞，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：將細(xì)胞鋪板待密度達(dá)到90%以上后進(jìn)行劃線，使用200μl 槍頭在每孔進(jìn)行劃痕，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次，換成無血清培養(yǎng)基后給每孔劃痕拍照。將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，24h 后再次給每孔劃痕拍照。

1.3.8 蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)KLF3 蛋白的表達(dá)：使用細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞樣本，4℃ 12 000r/min 離心10min 后（離心半徑6.26cm），獲得蛋白樣品，采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。取相應(yīng)體積的蛋白并加入上樣緩沖液，混勻后，沸水浴加熱3min，使蛋白變性。采用10g/dl SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行蛋白分離，電泳先用80 V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用120 V，電泳1 ～2 h。在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電流為300mA，時(shí)間為60 min。轉(zhuǎn)膜后把膜放入洗滌液中漂洗1 ～2 min，再將膜放入封閉液中室溫封閉60 min。一抗（1:1 000）4℃過夜，二抗室溫下孵育2 ～3h，顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.3.9 熒光定量PCR 檢測(cè)各分組基因表達(dá)：TRIzol法提取各組總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)RNA 的純度和濃度。通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH 或U6 為內(nèi)參，每個(gè)基因擴(kuò)增設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)，伯樂熒光PCR 儀上分析（SYBR Green 熒光染料法）。LncRNA NEAT1 正向引物序列：5’-GTTTGCCTGCCTTCTTGTG-3，反向引物序列：5’-TACCCTCCCAGCGTTTAGC-3’； miR-23b-3p 正向引物序列：5’-CGATCACATTGCCAGGGA T-3’，反向引物序列：5’-AGTGCAGGGTCCGAGG TATT-3’；KLF3 正向引物序列：5’-GAGGCGATCG CCATGCTCATGTTTGACCCAGTTC-3’，反向引物序列：5’-GCGACGCGTTCAGACTAGCATGTGGCG TTTC-3’；GAPDH 正向引物序列：5’-TGACTTC AACAGCGACACCCA-3’，反向引物序列：5’-CAC CCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；U6 正向引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’?；蛳鄬?duì)表達(dá)量以2-△△Ct（△△Ct=△Ct試驗(yàn)-△Ct對(duì)照）法計(jì)算。

1.3.10 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：將含有預(yù)測(cè)的miR-23b-3p 靶位點(diǎn)3’-UTR 的野生型（wt）或突變型（mut）NEAT1, KLF3基因克隆到pGL3載體（Promega公司提供，上海）。再使用Lipofectamine 2000 將構(gòu)建好的載體與mimics miR-23b-3p 共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，每組重復(fù)3 次；轉(zhuǎn)染48 h 后，雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega）用于分析熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，定量結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。如數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M (P25, P75)]表示。兩組之間定量數(shù)值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生物信息學(xué)分析采用R 軟件或在線工具完成。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織NEAT1, miR-23b-3p,KLF3 的表達(dá)及三者相關(guān)性比較 見表1。TCGA數(shù)據(jù)庫分析得知，NEAT1 和 KLF3 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，miR-23b-3p 在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。其中, NEAT1 與KLF3 表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.26,P＜0.01），miR-23b-3p 與NEAT1，KLF3 表達(dá)量均呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.14,P=0.008;r=-0.17,P=0.001）。

表1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織NEAT1, miR-23b-3p,KLF3 的表達(dá)

2.2 干擾NEAT1 表達(dá)（siNEAT1 組）對(duì)HT29 細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移和侵襲的影響 見表2。si-NEAT1 組的凋亡率顯著高于Control 組（P＜0.05），見圖1A1&A2。siNEAT1 組G0/G1 期細(xì)胞比例明顯少于對(duì)照組（P＜0.001），見圖1B1&B2。siNEAT1 組S 期細(xì)胞比例顯著高于Control組（P＜0.001）。siNEAT1組細(xì)胞明顯的被阻滯在S 期。siNEAT1 組的侵襲能力明顯低于Control 組和NC組（t=8.33, 6.54, 均P＜0.01），siNEAT1 組的增殖能力明顯低于Control 組和NC 組（t=5.17, 2.92, 均P＜0.01），siNEAT1 組的遷移能力明顯低于Control組(U=0,P＜0.01)。

圖1 siNEAT1 對(duì)HT29 細(xì)胞凋亡和周期的影響

表2 siNEAT1 對(duì)HT29 細(xì)胞侵襲、增殖和遷移的影響

2.3 miR236-3p 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 見圖2。在線工具STARBASE 等預(yù)測(cè)miR-23b-3p 可同時(shí)與NEAT1 和KLF3 3’UTR 互補(bǔ)配對(duì)（圖2A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，插入wt-NEAT1 或wt-KLF3 序列的載體與mimics miR-23b-3p 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞后，熒光素酶活性顯著降低；而插入mut-NEAT1 或mut-KLF3 序列的載體與mimics miR-23b-3p 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞后，熒光素酶活性沒有明顯變化，驗(yàn)證了NEAT1 和KLF3 與miR-23b-3p 的靶向結(jié)合（圖2B～E）。

2.4 NEAT1 通過miR-23b-3p 對(duì)KLF3 表達(dá)的影響見圖3。與NC 組相比，siNEAT1 組的miR-23b-3p表達(dá)顯著上調(diào)（ 2.02±0.33 vs 1.05±0.11），KLF3轉(zhuǎn)錄(0.36±0.16 vs 1.00±0.09)和蛋白(0.56±0.08 vs 1.12±0.19 )表達(dá)顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.840 6, 6.038 5, 1.704 9, 均P＜0.05）。與si-NEAT1 組相比，si-NEAT1+miR-23b-3p inhibitor 組miR-23b-3p 表達(dá)下調(diào)(1.23±0.15 vs 2.02±0.33)，KLF3 轉(zhuǎn)錄(1.18±0.16 vs 0.36±0.16)和蛋白(1.14±0.12 vs 0.56±0.08)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.774 8，6.276 8，6.965 6，均P＜0.05）。

圖2 miR-23b-3p 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

圖3 NEAT1 通過miR-23b-3p 對(duì)KLF3 表達(dá)的影響

3 討論

NEAT1 已被證實(shí)在乳腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤等發(fā)揮著重要的致癌作用，且多與腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)[10-14]。乳腺癌的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NEAT1 沉默能有效降低腫瘤生長(zhǎng)并能顯著提升腫瘤對(duì)化療藥物順鉑的敏感度[15]。卵巢癌中，敲降NEAT1 基因表達(dá)能通過調(diào)控miR-770-5p/PARP1 軸顯著抑制順鉑的耐藥性[16]。NEAT1 還可通過WNT/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展[17]。本研究表明，NEAT1 在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，并且NEAT1 作為致癌基因促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和抑制細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體外結(jié)直腸癌細(xì)胞中，miR-23b-3p 分子可特異結(jié)合NEAT1 和KLF3 分子。因此，探討NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 軸在結(jié)直腸癌中如何發(fā)揮作用具有重要意義。

在結(jié)直腸癌組織中，有研究者利用微陣列芯片基因分析法和RT-PCR 檢測(cè)，不斷發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA，miRNA 也因此被作為結(jié)腸癌的潛在生物標(biāo)志物[18-19]。miR-23b-3p 可通過下調(diào)ZNF281 來提升結(jié)直腸癌對(duì)5’FU 化療的敏感度，且其在多種腫瘤中扮演著抗癌角色[20]。又有研究表明miR-23b-3p 在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中顯著下調(diào)，并能抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[21-23]，這和本文的研究結(jié)果一致，可能進(jìn)一步證實(shí)其在結(jié)直腸癌中的腫瘤抑制作用。本研究證實(shí)miR-23b-3p 被NEAT1 分子負(fù)向調(diào)控，這主要是其通過吸附miR-23b-3p 分子而實(shí)現(xiàn)的。國內(nèi)外多項(xiàng)研究證明，miR-23b-3p 被認(rèn)為是多種腫瘤細(xì)胞生理中重要的調(diào)控分子。miR-23b-3p 可以通過靶向結(jié)合多個(gè)下游基因分子（FZD7，PLAU，PTEN 等）調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]。miR-23b-3p 可能參與多種腫瘤發(fā)病機(jī)制的調(diào)控，如通過miR-23b-3p/MRC2軸調(diào)控卵巢癌的預(yù)后發(fā)展[25]，miR-23b-3p 的過表達(dá)可能抑制人宮頸癌CasKi 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[26]。這些結(jié)果均有利的證明miR-23b-3p 在結(jié)直腸癌和其他腫瘤中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

據(jù)我們所知，KLF3 在肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等[27-29]多種腫瘤中發(fā)揮著致癌基因的作用，但是其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況卻鮮見報(bào)道。生物信息學(xué)分析表明，KLF3 在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且和NEAT1 呈顯著正相關(guān)。miR-23b-3p 和NEAT1，KLF3 均呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），NEAT1 和KLF3呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。這些結(jié)果有利于證明NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 軸在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮調(diào)控作用。體外生物細(xì)胞學(xué)功能研究進(jìn)一步在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29 中證實(shí)miR-23b-3p 能夠靶向結(jié)合下游基因KLF3，KLF3 轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)又受到NEAT1 和miR-23b-3p 分子的精確調(diào)控，這可能說明KLF3 在結(jié)直腸癌中也是一種致癌基因，NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 軸在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，NEAT1 可通過靶向結(jié)合miR-23b-3p 來上調(diào)KLF3 表達(dá)。但這些仍需要更加詳盡的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

誠然，本研究也存在一定的不足。首先，仍然需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明NEAT1/miR-23b-3p/KLF3的作用。其次，本研究?jī)H選用一種結(jié)直腸癌細(xì)胞系進(jìn)行研究，且未對(duì)KLF3 分子做深入細(xì)致的機(jī)制研究等。總之，我們通過體外研究對(duì)NEAT1 基因進(jìn)行一定的功能驗(yàn)證，初步證實(shí)了其在結(jié)直腸癌中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞凋亡的功能，鑒定了一種新的 NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 調(diào)控軸，可能對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制和潛在靶點(diǎn)研究提供新的思路和策略。