沈運濤，蔡篤雄

（1.?？谑协偵絽^(qū)婦幼保健院兒科，?？?571100；2. 海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，海口 570102）

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，非小細胞肺癌（NSCLC）發(fā)生率約占肺癌總發(fā)生率的80%～85%，其亞型中肺鱗狀細胞癌死亡率較高，年死亡率約為40 萬[1-3]。目前，針對特定基因靶向藥物的開發(fā)已大大改善了肺鱗狀細胞癌(squamous cell lung carcinoma, SQCLC)患者的治療現(xiàn)狀，然而仍有一小部分肺鱗狀細胞癌患者具有驅(qū)動基因靶向治療，導致5年生存率＜5%，原因是鉑類化療藥的副作用[4]。因此，探究肺鱗狀細胞癌的發(fā)病分子機制對于開發(fā)更有效的治療方案顯得至關(guān)重要。近年二代測序和生物信息學技術(shù)證實只有1%～2%的人類基因組可以編碼蛋白質(zhì)，沒有編碼潛力的RNA 根據(jù)長度被分成短鏈非編碼RNA 和長鏈非編碼RNA（lncRNAs，≥200nt）兩個亞類[5]。研究表明，lncRNAs 通過多種機制對多種生物過程產(chǎn)生影響，包括翻譯抑制、mRNA 降解、RNA 誘餌、招募染色質(zhì)修飾因子、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等[6]，暗示lncRNAs 可作為預測患者預后生存的分子標志物[7]。且表明，lncRNAs 異常表達參與人類疾病的發(fā)展過程，特別是癌癥的發(fā)生發(fā)展[8]。因此，本研究通過數(shù)據(jù)庫篩選出肺鱗狀細胞癌中差異性表達最顯著lncRNA，并探究了其在肺鱗狀細胞癌中的作用及其參與肺鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的分子作用機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象 人肺鱗狀細胞癌細胞SK-MES-1 購于上海細胞庫，含10g/dl 胎牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時加入鏈霉素100 μg/ml 和青霉素100 IU/ml，培養(yǎng)在含5ml/dl 的CO2和95%濕度的37℃培養(yǎng)箱中。同時選取2020年12月期間本院收治的4 例人肺鱗狀細胞癌患者癌組織及其對應正常肺組織標本進行研究，標本來自醫(yī)院病理科，于低溫液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)液（美國Gibco 公司），鏈霉素、青霉素（北京索萊寶科技有限公司），PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司），Lipo2000（美國Invitrogen 公司），酶標儀（美國Bio-rad 公司），MTS 反應液（南京凱基生物技術(shù)有限公司），MIR205HG 干擾siRNA 序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 臨床數(shù)據(jù)篩選及編碼能力預測：檢索GEPIA[9]臨床數(shù)據(jù)庫，以tumor/normal ＞2 為條件篩選出在肺鱗狀細胞癌中差異性最高表達的lncRNA，并通過檢索PholyCSF[10]數(shù)據(jù)庫預測目的lncRNA 編碼蛋白質(zhì)的潛力。

1.3.2 實時熒光定量PCR 實驗（RT-qPCR）：采用TRIzol 試劑盒提取細胞及組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板配置PCR 反應體系為cDNA 4 μl，qPCR mix 5 μl，primer 1 μl，加ddH2O 至總體積為20 μl，行PCR 擴增反應。反應條件：95℃35 s，95℃ 20 s，72℃ 15 s，循環(huán)40 次。使用primer 3 設(shè)計特異性qPCR 引物，引物序列MIR205HG 正向：5’-GCGATGACATTCGCAGCG-3’，反向：5’-CA GTGCCTGTGCTGCAGT-3’；GAPDH 正向：5’-ACG AGAGTGCATGGCTCAC-3’，反向：5’-CGAGCAGG CTGTTCGTGTAG-3’；采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達。

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染：以6 孔板為例：將10 μl MIR205 HG-siRNA 與50 μl Opti-MEM 培養(yǎng)液混勻，將5 μl上述混勻液與2 μl 脂質(zhì)體合并混勻，靜置20 min后常規(guī)培養(yǎng)6 h，更換無血清培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞進行后續(xù)實驗檢測。

1.3.4 細胞增殖實驗檢測：取轉(zhuǎn)染后待測細胞以1×105個/孔鋪于96 孔板，每組設(shè)3 個生物重復，培養(yǎng)48 h。按照MTS ∶培養(yǎng)液=1∶20 比例配制MTS 反應液，每孔加入反應溶液約100 μl，每30 min 檢測一次吸光度。每孔加入150 μl 二甲基亞砜，置搖床低速振蕩10 s，使結(jié)晶物充分溶解，490 nm處測各孔吸光度值，繪制細胞增殖曲線。

1.3.5 克隆形成實驗檢測：取轉(zhuǎn)染后待測細胞以1×106個/孔鋪于6 孔板，每個樣品做3 個生物重復，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時收集細胞，PBS 洗滌兩次，常溫固定5 min，含0.5g/dl 結(jié)晶紫甲醇溶液固定15 min，水洗掉紫色背景，晾干掃描，10g/dl醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，測量590 nm 處測吸光度值。

1.3.6 基因功能分析：檢索cBioPortal[11]數(shù)據(jù)庫找尋MIR205HG 的共表達基因，經(jīng)metascape 行通路分析。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0 軟件進行實驗結(jié)果分析，每個實驗均設(shè)計三次重復，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，癌組織及對應癌旁組織中差異比較采用配對t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選具有臨床意義的LncRNA 研究檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫共找到在肺鱗狀細胞癌中差異表達的lncRNA 有289 個，其中63 個在癌組織中高表達，226 個在正常組織中高表達，通過火山圖篩選出在肺鱗狀細胞癌中高表達且對比正常組織表達差異最顯著的MIR205HG，見圖1a。通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，MIR205HG 僅在部分組織和腫瘤中表達，相較于肺腺癌，MIR205HG 僅在肺鱗狀細胞癌中高表達（P＜0.05），見圖1b；同時發(fā)現(xiàn)相比338 例正常組織（1.084±0.036），MIR205HG 在486 例肺鱗狀組織（6.785±0.462）中顯著高表達，差異有統(tǒng)計學意義（t=188.873，P=0.000），暗示了MIR205HG在肺癌且僅在肺鱗狀細胞癌中具有作用。

圖1 篩選具有臨床意義的lncRNA

2.2 探究MIR205HG 在肺鱗狀細胞癌中發(fā)揮功能的形式 研究通過PholyCSF 數(shù)據(jù)庫對MIR205HG的編碼能力進行預測，發(fā)現(xiàn)MIR205HG 不具有蛋白編碼能力，其通過lncRNA 形式在肺鱗狀細胞癌中發(fā)揮功能。

2.3 研究MIR205HG 在肺鱗狀細胞癌中的重要性見圖2。研究提取4 組臨床正常肺組織和肺鱗狀細胞癌組織中RNA，通過DNA 電泳（圖2a）以及qPCR 實驗（圖2b），均驗證了MIR205HG 在肺鱗狀細胞癌組織中高表達（P＜0.05）；通過檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，臨床分期越高MIR205HG 表達水平越高（P=0.047 2，圖2c）。通過轉(zhuǎn)染2 條shRNA至肺鱗狀細胞癌細胞，檢測發(fā)現(xiàn)shMIR205HG#1 組和shMIR205HG#2 組細胞中MIR205HG 表達分別為0.289±0.046，0.304±0.051，明顯低于轉(zhuǎn)染無義序列shCTL 對照組的1.000±0.003，差異有統(tǒng)計學意義（F=314.271，P＜0.001），提示敲降MIR205HG 表達轉(zhuǎn)染成功。細胞增殖實驗檢測顯示，轉(zhuǎn)染72h 時shMIR205HG#1 組和shMIR205HG#2組細胞增殖率分別為0.709±0.032，0.736±0.026，明顯低于shCTL 對照組的0.988±0.039，差異有統(tǒng)計學意義（F=66.163，P＜0.001）。細胞克隆實驗檢測發(fā)現(xiàn)shMIR205HG#1 組和shMIR205HG#2 組細胞克隆形成速率分別為0.324±0.021，0.402±0.023，亦明顯低于shCTL 對照組的1.809±0.019，差異有統(tǒng)計學意義（F=423.093，P＜0.001），提示敲低MIR205HG 表達可明顯抑制肺鱗狀細胞癌細胞的增殖及克隆形成。

2.4 探究MIR205HG 在肺鱗狀細胞癌中發(fā)揮功能的作用方式 見圖3。研究在數(shù)據(jù)庫中找到與MIR205HG 共表達的基因，通過KEGG 和HallMark信號通路分析發(fā)現(xiàn)，MIR205HG 可能參與P53 這個重要的致癌信號通路（圖3a）。通過蛋白質(zhì)免疫印跡驗證發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRNA 介導敲低MIR205HG 時，shMIR205HG#1 組和shMIR205HG#2 組細胞中P53表達分別為5.988±0.321，5.702±0.345，下游重要的P21 蛋白表達分別為3.857±0.362，3.698±0.314，均明顯高于shCTL 對照組的1.022±0. 152，1.106±0.253，差異均有統(tǒng)計學意義（F=285.386，73.106，均P＜0.001，圖3b），提示MIR205HG 可能通過下調(diào)P53 以及抑制其介導的信號通路，從而促進肺鱗狀細胞癌的生長增殖。

圖2 研究MIR205HG 在肺鱗狀細胞癌中的重要性

圖3 探究MIR205HG 在肺鱗狀細胞癌中發(fā)揮功能的作用方式

3 討論

近年，越來越多證據(jù)發(fā)現(xiàn)LncRNA 參與了包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的進展和轉(zhuǎn)移[12]，為腫瘤的臨床研究及診治提供了新的目標和思路。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄物大小超過200 個核苷酸的非編碼RNA[8]。LncRNA 在結(jié)構(gòu)上與mRNA 相似，但其具有更高的組織表達特異度[13]。LncRNAs 可作為識別癌癥的特異性生物標志物和功能驅(qū)動因子。大量研究表明，LncRNAs 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化學耐藥中都起著重要作用，例如：LncRNAs CCAT1 下調(diào)增強了人結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感度[14]。LncRNAs-GAS5/miR-221-3p/DKK2 軸通過Wnt/βcatenin 信號通路調(diào)控abcb1 介導的乳腺癌阿霉素耐藥[15]。LncRNA TUC338 通過激活MAPK 通路促進了肺癌的增殖、侵襲及遷移[16]。近年眾多研究也發(fā)現(xiàn)，多種lncRNAs 與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如LncRNA MALAT1 通過調(diào)節(jié)miR - 124/STAT3 軸參與非小細胞肺癌的發(fā)生[17]。體外實驗表明，敲低PVT1 會抑制肺鱗狀細胞癌的細胞增殖、遷移和侵襲[18]。CCAT2 通過調(diào)節(jié)Wnt /β-catenin 信號通路促進肺鱗狀細胞癌的發(fā)生[19]。因此，找尋更多肺鱗狀細胞癌中特異性表達的分子靶標，探究其表達發(fā)揮作用對臨床治療及攻克意義顯著。

本研究首先通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫找到在肺癌中差異表達的lncRNA 有289 個，進一步篩選到在肺癌中過表達且相比于正常組織表達差異最明顯的MIR205HG 作為研究目的基因，探究發(fā)現(xiàn)其主要通過lncRNA 形式在肺鱗狀細胞癌中發(fā)揮功能。既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MIR205HG 通過調(diào)控miR-122-5p 加速宮頸癌腫瘤細胞的生長進展[20]。lncRNA MIR205HG 能夠引起Hsa-miR-590-3p 缺失導致頭頸部鱗狀細胞癌不受抑制的增殖，促進其發(fā)展進程[21]。LncRNA MIR205HG 通過miR-299-3p/VEGFA 軸支持黑色素瘤的生長，是黑色素瘤治療的潛在靶點[22]。LncRNA MIR205HG 在食管腺癌細胞中表達下調(diào)，其過表達可抑制體外細胞的增殖和細胞周期進程，涉及對Hh 信號通路的調(diào)控作用[23]；且發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控miR-214/SOX4 軸驅(qū)動了食管鱗狀細胞癌的進展[24]。提示MIR205HG 在臨床癌癥中的癌基因作用，故進一步探究其在肺鱗狀細胞癌中的作用機制十分必要。研究通過經(jīng)典的分子生物學實驗驗證發(fā)現(xiàn)MIR205HG 可促進肺鱗狀細胞癌的生長增殖和克隆形成。進一步分析發(fā)現(xiàn)MIR205HG可能參與P53 致癌的信號通路。P53 關(guān)鍵靶基因P21 和14-3-3σ 在幾種類型的人類腫瘤中的異常表達，被認為是腫瘤抑制因子，以P53 依賴性方式發(fā)揮功能[25]。而研究通過敲低MIR205HG 對P53 及其關(guān)鍵靶基因的表達進行驗證，發(fā)現(xiàn)敲降其表達會促進P53 以及其下游關(guān)鍵靶基因P21, 14-3-3σ 的表達，由此說明了MIR205HG 可能通過調(diào)控P53 表達，并阻斷其參與的信號通路來發(fā)揮作用參與肺鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展。本研究從基因篩選、發(fā)揮作用形式、功能驗證和作用機制探討四個方面探究了MIR205HG 在肺鱗狀細胞癌中的重要作用，但其功能機制尚不夠全面深入，故后期還需進一步的研究闡明。

綜上所述，lncRNA MIR205HG 在肺鱗狀細胞癌中顯著高表達，其參與調(diào)控肺鱗狀細胞癌的增殖與P53 信號通路密切相關(guān)，可將其作為肺鱗狀細胞癌的潛在藥物治療靶點。