寧寧，唐啟勝，楊愉晨，趙衛(wèi)合，楊龍飛

1.西北婦女兒童醫(yī)院病理科，陜西 西安 710061；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710038；3.西安市精神衛(wèi)生中心檢驗科，陜西 西安 710061；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院放療科，陜西 西安 710038；5.空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院中心實驗室，陜西 西安 710038

乳腺癌是最常見的女性腫瘤之一，是發(fā)生于乳腺的上皮性惡性腫瘤。放射治療是乳腺癌治療的主要手段之一，有研究認(rèn)為乳腺癌對低劑量放射線不敏感，其中具體機制不明[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)對人類基因的表達具有重要的調(diào)控作用，能夠影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移，對腫瘤診斷與治療具有潛在價值。有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中長鏈非編碼RNA GATA6反義RNA 1(GATA6-AS1)表達降低，且與預(yù)后不良有關(guān)[2]。GATA6-AS1與腫瘤細胞放射敏感性間的關(guān)系尚不明確。為了研究乳腺癌更合理的放療方式，為臨床放療選擇提供依據(jù)，本研究擬探討X線不同分割劑量放療方案對乳腺癌MCF-7細胞增殖、細胞凋亡以及GATA6-AS1基因及其鄰近基因表達產(chǎn)物GATA6表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 細胞培養(yǎng)試劑DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶與新生牛血清購自Gibco公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自翌圣公司。RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR green PCR mix購自Invitrogen公司。兔抗人GATA6單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購自CST公司。

1.2 細胞與處理 人乳腺癌MCF-7細胞來源于ATCC菌種庫，使用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)。實驗分為小分割組(每次0.5 Gy，共8次)、大分割組(每次2 Gy，共2次)和對照組(無照射)。小分割組每天給予4次X線照射，每次0.5 Gy，間隔3 h照射，共8次；大分割組每天照射1次，每次2 Gy，共照射兩次。兩組細胞給予放射線總劑量相同，均在48 h內(nèi)完成。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖 將三組乳腺癌細胞MCF-7培養(yǎng)至對數(shù)期后，用0.25%胰蛋白酶消化，以5×103/孔密度鋪96孔細胞培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。實驗組按上述設(shè)定方案給予X線照射，分別于24 h、48 h和72 h后每孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，450 nm波長檢測OD值，繪制生長曲線。

1.4 流式細胞儀檢測不同分割劑量照射對MCF-7細胞凋亡的影響 照射組與未照射組乳腺癌細胞MCF-7生長至對數(shù)期后，以5×105/孔密度鋪6孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。實驗組按上述方案給予X線照射，于48 h后用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 qRT-PCR法檢測GATA6-AS1基因表達變化 乳腺癌細胞MCF-7生長至對數(shù)期后，按預(yù)定方案給予X線照射，分別于24 h與48 h后使用Trizol法提取照射組與對照組細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR green PCR mix進行qRT-PCR檢測。

1.6 Western blot法檢測GATA6蛋白表達變化 乳腺癌細胞MCF-7生長至對數(shù)期后，按預(yù)定方案給予X線照射，48 h后提取照射組與對照組細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，Western blot法檢測GATA6蛋白表達。兔抗人GATA6單克隆抗體(1∶1 000)，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶2 000)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用Student t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小分割與大分割放射線照射對MCF-7細胞增殖的影響 將MCF-7細胞分為小分割組與大分割組，放射線總劑量4 Gy，通過CCK-8法檢測24 h、48 h與72 h細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)大分割組MCF-7細胞的增殖抑制較小分割組更明顯，72 h抑制率可達(57.0±8.86)%，分別與對照組及小分割組分別比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同分割劑量照射后MCF-7細胞的增殖活力比較(±s)

表1 不同分割劑量照射后MCF-7細胞的增殖活力比較(±s)

注：與對照組比較，a P＜0.05，與小分割組比較，b P＜0.05。

組別對照組小分割組大分割組F值P值0 h 0.98±0.09 1.02±0.14 0.99±0.11 0.06 0.94 24 h 1.21±0.15 0.92±0.13 0.84±0.10 7.96＜0.01 48 h 1.63±0.13 0.74±0.15a 0.54±0.17a 47.2＜0.01 72 h 2.01±0.15 0.75±0.17a 0.43±0.19b 170.46＜0.01細胞活力(OD450 nm)

2.2 小分割與大分割放射線照射對MCF-7細胞凋亡的影響 將MCF-7細胞分為小分割組與大分割組，放射線總劑量4 Gy，通過流式細胞儀檢測照射后48 h細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)大分割法放射線照射對MCF-7細胞的凋亡促進更明顯，凋亡率達到(19.07±2.38)%，小分割組凋亡率為(13.22±2.71)%，而對照組凋亡率僅為(4.81±0.40)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=84.24，P＜0.05)，見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測不同分割劑量照射對MCF-7細胞凋亡的影響

2.3 小分割及大分割放射線照射對MCF-7細胞GATA6-AS1基因表達的影響 qRT-PCR法檢測結(jié)果表明，放射線照射能夠增強MCF-7細胞中GATA6-AS1基因的表達，大分割組GATA6-AS1基因增強更明顯，48 h達到對照組的(2.13±0.19)倍，與小分割組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.8894，P＜0.01)，見表2。

表2 不同分割劑量照射后MCF-7細胞內(nèi)GATA6-AS1基因表達水平比較(±s)

表2 不同分割劑量照射后MCF-7細胞內(nèi)GATA6-AS1基因表達水平比較(±s)

注：與對照組比較，a P＜0.05，與小分割組比較，b P＜0.05。

組別對照組小分割組大分割組F值P值24 h 1.00±0.00 1.16±0.07 1.33±0.14 9.94＜0.05 48 h 1.00±0.00 1.31±0.08 2.13±0.19ab 72.09＜0.01 GATA6-AS1基因FC值

2.4 小分割及大分割放射線照射對MCF-7細胞GATA6-AS1鄰近蛋白GATA6表達的影響 Western blot法檢測結(jié)果表明，放射線照射能夠降低MCF-7細胞中GATA6-AS1鄰近蛋白GATA6的表達，大分割組GATA6下調(diào)作用更明顯，見圖2。

圖2 不同分割劑量照射對MCF-7細胞GATA6蛋白表達的影響

3 討論

腫瘤細胞的異常增殖是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，放射線照射能夠通過產(chǎn)生次級電子引起電離效應(yīng)，誘發(fā)腫瘤細胞產(chǎn)生自由基，最終導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。放療是乳腺癌術(shù)后主要的輔助治療手段，可以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但放療同時會造成正常組織的損傷，放射劑量越大，損傷越大，如何保證療效的同時降低放療劑量依舊是臨床難題。近期大量前瞻性隨機對照研究表明，采用短程大分割放療方案治療早期乳腺癌，具有與傳統(tǒng)分割方案相同的療效而不增加副反應(yīng)的優(yōu)點[3-4]。李金高等[5]發(fā)現(xiàn)總劑量相同的情況下，給予小分割方案多次小劑量照射能夠抑制鼻咽癌細胞增殖，抑制效果明顯優(yōu)于大分割照射方案。小劑量照射被認(rèn)為具有損傷小、費用低、耐受性好、可誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)等優(yōu)點[6]。為了探討乳腺癌更合理的放療方式，為臨床放療選擇提供依據(jù)，本研究分別使用小分割及大分割法照射乳腺癌MCF-7細胞，然后通過CCK-8法與流式細胞儀檢測兩種照射法對乳腺癌細胞增殖與凋亡的影響。乳腺癌的臨床治療中，常規(guī)放射線放療劑量定義為2 Gy/次，存在人體組織的干擾；而在細胞學(xué)研究中，因細胞沒有周圍組織的干擾而對放射線照射更敏感，殺傷效果更強，本研究參考李金高等[5]的鼻咽癌細胞放療方案，將2 Gy/次定義為細胞水平大分割，0.5 Gy/次定義為細胞水平小分割。CCK8實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌MCF-7細胞對小分割低劑量照射不敏感，而大分割放射線照射對其增殖具有明顯的抑制作用。采用流式細胞術(shù)進一步檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，大分割法放射線照射對MCF-7細胞的凋亡促進也更明顯，這與鼻咽癌細胞研究結(jié)果不一致。其中原因尚不清楚，ENNS等[1]認(rèn)為腫瘤細胞對低劑量放射線敏感性與p53依賴的細胞凋亡信號通路有關(guān)。

為進一步探索乳腺癌細胞對小分割放療不敏感的機制，本研究從lncRNA和蛋白表達水平方面進行了驗證。lncRNA參與細胞生長、分化、凋亡以及核內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)榷喾N生物學(xué)過程，并在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多個方調(diào)控基因的表達。近年來研究表明，LncRNA的異常表達與包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中GATA6的反義RNA1(GATA6-AS1)是一種新型的腫瘤抑制因子，能夠抑制肺癌和胃癌細胞增殖和侵襲[7-8]。在卵巢癌、胰腺癌等組織中GATA6-AS1被認(rèn)為是一種抑癌基因[9]，而在乳腺癌組織中，GATA6-AS1的作用尚不清楚，有研究認(rèn)為GATA6-AS1在乳腺癌組織中表達水平降低與腫瘤體積大、臨床分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER-2擴增有關(guān)，GATA6-AS1的低表達是乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)[2]。本研究發(fā)現(xiàn)在總放射劑量相同時，大分割放射線照射后乳腺癌MCF-7細胞增殖能力較小分割照射后明顯降低，同時GATA6-AS1基因表達升高更明顯，說明兩者之間存在關(guān)聯(lián)，大分割放療方法通過某種途徑誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)GATA6-AS1基因表達提高，從而改善乳腺癌預(yù)后。但是GATA6-AS1基因相關(guān)蛋白表達是否存在同樣的變化趨勢仍是未知。GATA6蛋白是GATA蛋白家族中的一員，在膽管癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中呈高表達[10-12]。Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞放療后GATA6蛋白表達下降，且大分割放射線照射后GATA6蛋白下降更明顯，這與細胞增殖能力及GATA6-AS1基因表達變化趨勢一致，推測GATA蛋白也參與了低劑量放射線照射對乳腺癌細胞增殖的敏感性，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，乳腺癌細胞對大分割放射線照射更敏感，其中機制可能與GATA6-AS1升高及GATA6蛋白表達下降有關(guān)。