王 斌，胡昱博，童柳霞，張 潔，胡 波

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)基礎醫(yī)學院：生理學教研室1，五大隊15隊2；400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學中心骨科3

協(xié)調機體處于適宜的覺醒狀態(tài)，對保證運動行為的精確發(fā)生具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)：腹內側丘腦(ventromedial thalamus，VM)可能是協(xié)調覺醒水平與運動發(fā)生的關鍵神經(jīng)結構。一方面，VM神經(jīng)元可以向前外側運動皮層發(fā)出興奮性投射，影響運動皮層神經(jīng)元的持續(xù)放電活動，進而參與運動準備和啟動。另一方面，VM神經(jīng)元還可以投射至大腦皮層的廣泛區(qū)域，調控大腦皮層淺層神經(jīng)元的興奮活動，提升機體的覺醒水平。此外，VM神經(jīng)元接受內側前額葉皮層、運動皮層、紋狀體和小腦等的信號輸入。因此，VM處于一個有利的解剖學位置，使其能夠整合機體運動和本體感覺等信息，進而通過軸突支配來協(xié)調覺醒水平與運動發(fā)生。盡管現(xiàn)有證據(jù)表明，VM具有促進覺醒的作用，但VM神經(jīng)元在不同腦功能狀態(tài)(如覺醒和睡眠)下的活動特征目前仍不完全清楚。探索這一問題將為揭示VM是如何整合信息并參與覺醒狀態(tài)調控提供基本認識。由于VM形狀細長、所處位置較深，準確記錄大量VM神經(jīng)元在覺醒-睡眠過程中的活動比較困難。在前期精確定位小鼠VM的基礎上，本研究擬將可推進微電極陣列植入VM，以連續(xù)監(jiān)測該區(qū)域神經(jīng)元的放電活動，并比較其與腹外側丘腦(ventrolateral thalamus，VL)區(qū)神經(jīng)元在不同覺醒-睡眠腦狀態(tài)及其相互轉換過程中的活動差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用雄性、3月齡C57/BL6野生型小鼠4只，體質量20～25 g[購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司，SYXK(渝)2017-0002]。在手術前適應、術后恢復以及記錄實驗期間，小鼠被置于光照∶黑暗為12 h∶12 h、溫度20～25 ℃的單籠標準飼養(yǎng)環(huán)境中。所有實驗操作符合陸軍軍醫(yī)大學動物福利倫理審查指南要求。

1.2 微電極陣列制作

剪取一段絕緣后直徑25 μm、長約25 cm的鎢絲(California Fine Wire，美國)。鎢絲對折之后，夾住兩端并對稱掛于鐵架臺上。對折使鎢絲變成4股垂直于實驗桌面，其下端懸掛一根鐵質磁力攪棒。利用磁力使攪棒旋轉，轉速500 r/min。用熱風槍固定形成4股螺旋狀的鎢絲tetrode電極。每組tetrode具有4個通道(Ch1～4)。將制備好的4組tetrode電極依次穿入平行排列的石英管(Polymicro Technologies，美國)。每組tetrode電極間距160 μm。而后各組tetrode電極連接微推進器和Omnetics電信號接頭。

1.3 微電極陣列植入手術

將小鼠放入麻醉誘導盒中，使用1%～1.5%異氟烷麻醉小鼠。在麻醉誘導成功后，將小鼠頭部固定于腦立體定位儀上。調節(jié)異氟烷濃度使小鼠的呼吸頻率控制在60～90次/min。調整顱骨水平，測量左、右對稱位置高度，使二者高度差<100 μm；測量前、后囟高度差，使二者高度差<200 μm。在雙側小腦上方對稱位置，鉆2個圓形小孔，植入2顆不銹鋼螺絲，分別作為地線與參考連接電極連接位點。在右側頂葉顱骨，植入1顆不銹鋼螺絲(坐標，前囟后：1.9 mm，旁開：1.7 mm)，以記錄皮層腦電活動。根據(jù)小鼠腦定位圖譜，在左側丘腦上方植入由4組tetrode鎢絲電極所組成的陣列，坐標如下：①VM區(qū)，前囟后1.6 mm、旁開0.3 mm、初始植入深度3.9 mm；②VL區(qū)，前囟后1.6 mm、旁開0.7 mm、初始植入深度3.9 mm。術后小鼠恢復5～7 d，待體質量成功恢復標準即術前水平后，再開始進行適應和電生理記錄。

1.4 電生理信號記錄

手術恢復后對小鼠進行記錄環(huán)境和操作流程適應訓練，共2 d。在此期間，通過微推進器將陣列電極尖端以70～105 μm/d的速度緩慢向VM或VL區(qū)域推進，直到可以穩(wěn)定記錄到VM或VL區(qū)神經(jīng)元的放電活動。用RHD2 000(Intan Technologies，美國)神經(jīng)數(shù)據(jù)采集器、以20 kHz采樣頻率對VM或VL神經(jīng)元單位放電信號、右側頂葉腦電信號進行采樣。電生理信號通過Neuro scope軟件實時監(jiān)測。電生理記錄均在當日10:00～14:00開展。每次記錄時間至少2.5 h。每只小鼠記錄2～3次。每次記錄結束后，微電極陣列需推進70～105 μm，以便在下一記錄日能夠記錄到新的VM或VL神經(jīng)元。

1.5 大腦覺醒-睡眠狀態(tài)判定

利用頂葉皮層的腦電活動和頭頸部三維加速度來反映小鼠的大腦覺醒-睡眠狀態(tài)。定義標準如下：①覺醒(wakefulness，Wake)：頂葉皮層呈現(xiàn)明顯的theta頻帶(5～10 Hz)振蕩，且小鼠頭頸部三維加速度明顯增加，持續(xù)時間>10 s。②非快速動眼(non-rapid eye movement，NREM)睡眠：頂葉皮層呈現(xiàn)高振幅、低頻(1～4 Hz)振蕩活動，且小鼠頭頸部無明顯的三維加速現(xiàn)象，狀態(tài)持續(xù)時間>10 s。③快速動眼(rapid eye movement，REM)睡眠：頂葉皮層呈現(xiàn)明顯theta頻帶(5～10 Hz)振蕩，但小鼠無頭頸部三維加速現(xiàn)象，且持續(xù)時間>10 s。

1.6 峰電位甄選

離線情況下對記錄到的原始數(shù)據(jù)進行帶通濾波(0.8～6.0 kHz)處理。使用KlustaKwik軟件對每組tetrode電極上所采集到的單位放電信號進行自動甄選并歸為不同特征的峰電位集群。再通過Klusters軟件進行手動判別和甄選，篩除KlustaKwik 軟件在自動甄選過程中誤判的噪聲(表現(xiàn)為不典型的動作電位波形)，最終獲得高信度的VM或VL神經(jīng)元峰電位信號。

1.7 記錄位點驗證

在全部記錄實驗完成之后，利用直流電(總時程：10 s，強度：30 μA)損毀記錄電極尖端處腦組織。損毀48 h后，給小鼠腹腔注射致死劑量的戊巴比妥鈉(注射量：0.4 mL，濃度：3%)。再經(jīng)心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛溶液各100 mL。將剝離后的腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，然后再轉移至30%蔗糖溶液中脫水24 h。使用冰凍切片機(CM1900，Leica，德國)，將脫水后的腦組織制成50 μm厚的冠狀切片。經(jīng)DAPI染色后，在熒光顯微鏡(BX53，Olympus，日本)下觀察電極尖端的位置。只有損毀位點明確在VM或VL區(qū)小鼠的生理記錄信號數(shù)據(jù)才可以被納入數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

將甄選出的VM和VL神經(jīng)元放電峰電位，按照小鼠腦功能狀態(tài)進行分類，分別計算VM和VL神經(jīng)元在不同腦功能狀態(tài)下的平均放電頻率，以及在不同狀態(tài)轉換時的放電頻率變化。此外，每個VM和VL神經(jīng)元的Wake-NREM調控指數(shù)由如下公式算得：(Wake狀態(tài)下平均放電頻率-NREM睡眠狀態(tài)下平均放電頻率)/(Wake狀態(tài)下平均放電頻率+NREM睡眠狀態(tài)下平均放電頻率)。每個VM和VL神經(jīng)元的REM-NREM調制指數(shù)則由如下公式算得：(REM睡眠狀態(tài)下平均放電頻率-NREM睡眠狀態(tài)下平均放電頻率)/(REM睡眠狀態(tài)下平均放電頻率+NREM睡眠狀態(tài)下平均放電頻率)。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠腹側丘腦區(qū)神經(jīng)元的在體電生理記錄和特性區(qū)分

為了確定VM神經(jīng)元在覺醒-睡眠周期中的放電活動特征及其變化，將微電極陣列植入到小鼠腹側丘腦。所有電生理記錄完成后的組織學鑒定結果顯示：在2只小鼠中，微電極陣列準確植入到VM區(qū)，見圖1A。而在另外2只小鼠中，微電極陣列植入到VL區(qū)域，見圖1B。本實驗的在體微電極多通道記錄均在日間時相開展，每次記錄的平均時間為(168.2±18.8)min。

A：VM區(qū)域；B：VL區(qū)域 黃色實線：示4組tetrode電極；虛線：示不同腦區(qū)的分界

進一步對小鼠VM和VL神經(jīng)元的電生理學特點進行研究。實驗共記錄和甄選出50個VM神經(jīng)元和40個VL神經(jīng)元的單位放電活動。結果顯示：VM神經(jīng)元和VL神經(jīng)元峰電位的谷-峰波寬均較寬，前者波寬為(0.68±0.01)ms(

n

=50)，見圖2A，后者波寬為(0.63±0.01)ms(

n

=40)，見圖2B。統(tǒng)計學分析顯示：VM神經(jīng)元峰電位的谷-峰波寬較VL神經(jīng)元更寬(

t

=1.975，

P

=0.004)，見圖2C。此外，VM神經(jīng)元的平均放電頻率為(2.98±0.36)Hz，VL神經(jīng)元平均放電頻率為(7.58±0.79)Hz。統(tǒng)計學分析顯示，VM神經(jīng)元的放電頻率顯著低于VL神經(jīng)元(

t

=-5.721，

P

<0.01)，見圖2D。以上實驗結果表明，VM和VL神經(jīng)元具有不同的在體電生理學特性。

A：Tetrode電極記錄的代表性VM神經(jīng)元單位發(fā)放的峰電位波形(Ch1～4，通道1～4)；B：Tetrode電極記錄的代表性VL神經(jīng)元單位發(fā)放的峰電位波形(Ch1～4，通道1～4)；C：VM神經(jīng)元(n=50)與VL神經(jīng)元(n=40)峰電位谷-峰波寬的比較；D：VM神經(jīng)元(n=50)與VL神經(jīng)元(n=40)平均放電頻率的比較 a：P<0.01

2.2 小鼠VM和VL神經(jīng)元在不同腦功能狀態(tài)下的放電活動特征

研究進一步對小鼠VM神經(jīng)元在覺醒-睡眠等不同大腦功能狀態(tài)下的活動進行分析。根據(jù)小鼠頂葉皮層腦電振蕩的頻率狀態(tài)及其頭頸部三維加速情況，可對覺醒和睡眠狀態(tài)進行判別。如圖3所示：覺醒狀態(tài)時，小鼠頂葉皮層會呈現(xiàn)出theta頻帶(5～10 Hz)的振蕩，且頭頸部三維加速度明顯增加。當處于NREM睡眠狀態(tài)時，小鼠頂葉皮層呈現(xiàn)高振幅、低頻(0.5～4.5 Hz)振蕩活動，但頭頸部無明顯的三維加速現(xiàn)象。REM睡眠狀態(tài)時，小鼠頂葉皮層呈現(xiàn)明顯的theta頻帶(5～10 Hz)振蕩，但無頭頸部三維加速現(xiàn)象，見圖3A。統(tǒng)計學結果顯示：VM神經(jīng)元在覺醒狀態(tài)下的放電頻率[(4.13±0.47)Hz]顯著高于NREM睡眠期[(2.46±0.34)Hz，

t

=7.541，

P

<0.01]和REM睡眠期[(2.35±0.32)Hz，

t

=7.917，

P

<0.01]，見圖3B。覺醒狀態(tài)下的放電頻率高于NREM和REM睡眠期的VM神經(jīng)元數(shù)量占記錄到VM神經(jīng)元總數(shù)的94%(47/50)，6%的VM神經(jīng)元未表現(xiàn)出這種特性。VM神經(jīng)元在NREM和REM睡眠期間的放電頻率差異則無統(tǒng)計學意義(

t

=-1.172，

P

=0.246)。VM神經(jīng)元的Wake-NREM調制指數(shù)(

F

-

F

)/(

F

+

F

)和REM-NREM調制指數(shù)(

F

-

F

)/(

F

+

F

)(F是神經(jīng)元在某狀態(tài)下的平均發(fā)放頻率)分析顯示：VM神經(jīng)元Wake-NREM調制指數(shù)呈以0.28為平均重心的單峰分布，與覺醒狀態(tài)相對應。而REM-NREM調制指數(shù)則呈以0為平均重心的分布，表明其與REM睡眠不相關(圖3C)。以上結果提示：VM神經(jīng)元的放電活動與覺醒狀態(tài)相關。與VM神經(jīng)元不同，VL神經(jīng)元放電頻率在覺醒狀態(tài)[(10.42±1.03)Hz，

t

=8.570，

P

<0.01]和REM睡眠期[(8.95±0.89)Hz，

t

=11.279，

P

<0.01]均高于NREM睡眠期[(3.68±0.62)Hz]，見圖3D。覺醒狀態(tài)下的放電頻率高于NREM睡眠期的VL神經(jīng)元數(shù)量占記錄到VL神經(jīng)元總數(shù)的92.5%(37/40)，7.5%的VL神經(jīng)元未表現(xiàn)出這種特性。VL神經(jīng)元的Wake-NREM調制指數(shù)(

F

-

F

)/(

F

+

F

)和REM-NREM調制指數(shù)(

F

-

F

)/(

F

+

F

)分析顯示，VL神經(jīng)元Wake-NREM調制指數(shù)呈以0.51為平均重心的單峰分布，而REM-NREM調制指數(shù)則呈以0.49為平均重心的單峰分布(圖3E)。以上結果提示：不同于VM神經(jīng)元，VL神經(jīng)元的放電活動可能與覺醒和REM睡眠兩種狀態(tài)均相關。

A：覺醒、NREM睡眠和REM睡眠狀態(tài)的區(qū)分；B：3種腦功能狀態(tài)下VM神經(jīng)元放電頻率的比較神經(jīng)元Wake-NREM和REM-NREM調制指數(shù)分布；D：3種腦功能狀態(tài)下VL神經(jīng)元放電頻率的比較神經(jīng)元的Wake-NREM和REM-NREM調制指數(shù)分布

2.3 小鼠VM和VL神經(jīng)元在不同腦功能狀態(tài)轉換過程中的放電活動變化

研究進一步探究VM神經(jīng)元是否會在大腦狀態(tài)轉換過程中發(fā)生活動變化。如圖4A所示，在從NREM睡眠向覺醒狀態(tài)的轉換過程中，88%(

n

=44)的VM神經(jīng)元表現(xiàn)出放電頻率的顯著增加(

t

=-7.971，

P

<0.01)。當從覺醒向NREM睡眠轉換時，76%的VM神經(jīng)元表現(xiàn)出放電頻率顯著降低(

t

=4.934，

P

<0.01)，見圖4B。當由REM睡眠向覺醒狀態(tài)轉換時，VM神經(jīng)元放電活動也會顯著增強(

t

=6.742，

P

<0.01)，見圖4C。其中，發(fā)放頻率增強的細胞占總數(shù)的88%。但在從NREM睡眠向REM睡眠轉換的過程中，VM神經(jīng)元的放電活動無明顯的變化(

t

=-0.901，

P

=0.372)，見圖4D。

A：NREM睡眠向覺醒轉換時VM神經(jīng)元放電活動的變化及其類型和比例；B：覺醒向NREM睡眠轉換時VM神經(jīng)元放電活動的變化及其類型和比例；C：REM睡眠向覺醒轉換時VM神經(jīng)元放電活動的變化及其類型和比例；D：NREM睡眠向REM睡眠轉換時VM神經(jīng)元放電活動的變化及其類型和比例

研究還對 VL神經(jīng)元在覺醒-睡眠轉換過程中的活動變化進行了分析。結果顯示：在從NREM睡眠向覺醒狀態(tài)轉換過程中，88%的VL神經(jīng)元表現(xiàn)出放電頻率顯著增加(

t

=-6.153，

P

<0.01)，見圖5A。當從覺醒狀態(tài)向NREM睡眠轉換時，94%VM神經(jīng)元表現(xiàn)出放電頻率顯著降低(

t

=9.429，

P

<0.01)，見圖5B。在從NREM睡眠向REM睡眠的轉換過程中，VL神經(jīng)元的放電活動顯著增強(

t

=-5.928，

P

<0.01)，見圖5D。而當由REM睡眠向覺醒狀態(tài)轉換時，VL神經(jīng)元放電活動則無明顯的變化(

t

=-1.559，

P

=0.126)，見圖5C。

A：NREM睡眠向覺醒轉換時VL神經(jīng)元放電活動的變化及其類型和比例；B：覺醒向NREM睡眠轉換時VL神經(jīng)元放電活動的變化及其類型和比例；C：REM睡眠向覺醒轉換時VL神經(jīng)元放電活動的變化及其類型和比例；D：NREM睡眠向REM睡眠轉換時VL神經(jīng)元放電活動的變化及其類型和比例

3 討論

為確定VM參與機體狀態(tài)調控的細胞活動機制，首先必須了解VM神經(jīng)元在諸如覺醒-睡眠過程中的放電活動特征。為此，本研究利用在體多通道記錄技術，觀察VM神經(jīng)元在小鼠覺醒-睡眠周期中的放電活動，結果發(fā)現(xiàn)：VM神經(jīng)元在覺醒狀態(tài)下的放電活動最強，而在NREM與REM睡眠狀態(tài)下的放電活動無顯著差異。在NREM睡眠與覺醒狀態(tài)轉換的過程中，VM神經(jīng)元具有顯著的放電活動變化。VM神經(jīng)元在覺醒-睡眠周期及其轉換過程中的活動特征與VL神經(jīng)元不同。

本研究結果顯示：小鼠VM神經(jīng)元的放電活動與覺醒狀態(tài)密切相關。此外，VM神經(jīng)元在從NREM睡眠向覺醒轉換的過程中放電活動顯著增加，而在從覺醒向NREM睡眠轉換的過程中放電活動顯著降低。近年研究報道，刺激VM神經(jīng)元可以促進NREM睡眠向覺醒轉換，結合本研究結果表明：VM可能具有促進覺醒的功能。由于VM神經(jīng)元還可投射支配前外側運動皮層參與運動發(fā)起，故其可能是協(xié)調覺醒與運動發(fā)生的關鍵神經(jīng)結構，發(fā)揮協(xié)調覺醒水平與運動發(fā)生相適應的作用。

那么，VM又是如何調節(jié)覺醒狀態(tài)的呢？前已述及，VM神經(jīng)元可廣泛投射并支配大腦皮層淺層。進一步的研究則發(fā)現(xiàn)，VM神經(jīng)元與大腦皮層中的錐體細胞和中間神經(jīng)元建立特異性的突觸聯(lián)系。本課題組前期的工作發(fā)現(xiàn)：刺激VM神經(jīng)元可以增強以扣帶皮層為代表的大腦皮層神經(jīng)元的興奮性。綜上表明，VM可以通過調控廣泛大腦皮層淺層神經(jīng)元的興奮性來調控覺醒狀態(tài)。作為上游信號輸入結構，前額葉皮層、運動皮層、紋狀體和小腦等則可分別將運動信息、本體感覺和痛覺等信息傳入VM。因此，VM可能整合上述信息，進而影響大腦皮層神經(jīng)元的興奮性，參與覺醒狀態(tài)的調控。今后需要進一步探索VM神經(jīng)元的覺醒相關放電活動又是如何被運動皮層、小腦皮層等區(qū)信號輸入所調控。

一直以來，VL被認為是聯(lián)系低位運動中樞(如腦干和脊髓)與運動皮層的紐帶。VL神經(jīng)元的放電活動與運動計劃、動作行為密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)：VM與VL神經(jīng)元在覺醒-睡眠周期中的活動模式不同。前者與中線丘腦相類似，低頻放電活動僅與覺醒相關。而后者的高頻放電活動則是與覺醒和REM睡眠兩種狀態(tài)均相關。近年有研究發(fā)現(xiàn)，刺激小腦投射至VM和VL的末梢，產(chǎn)生的興奮效應也不同。因此，盡管均是位于腹側丘腦，VM和VL在功能以及電生理特性上存在較大的區(qū)別。今后的研究需關注這些區(qū)別與哪些生理功能相對應。

本研究表明：在生理條件下，VM神經(jīng)元具有與覺醒相關的放電活動。結合既往研究發(fā)現(xiàn)，小腦功能異常的患者或動物表現(xiàn)出覺醒減少、睡眠增多的現(xiàn)象，以及小腦可整合多種信息并傳遞至VM的解剖學特點，故在今后有必要確定小腦-VM通路是否在覺醒狀態(tài)的調控過程中發(fā)揮作用。所得結果可能對拓展關于小腦非運動功能的新認識有重要意義。