游偉強，吳小延，葉才果，王莉平△，林立鵬，薛臨先，肖 楊

1.深圳市福田區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣東深圳518016；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心分子診斷科， 廣東廣州 510060；3.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室，廣東東莞523808

子宮內(nèi)膜癌是一種發(fā)生在子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤，以子宮內(nèi)膜樣腺癌最為常見，其在子宮內(nèi)膜癌中占80%～90%[1]。近年來，子宮內(nèi)膜樣腺癌呈現(xiàn)出發(fā)病年齡年輕化、發(fā)病率逐年上升的趨勢[2]。全球每年新發(fā)子宮體癌約25萬例，其中約75%為子宮內(nèi)膜癌。在子宮內(nèi)膜樣腺癌早期，患者可無任何臨床癥狀，即使其最常見的臨床表現(xiàn)——陰道不規(guī)則流血和陰道分泌物增多，也不具備特異性。陰道超聲檢查可對子宮內(nèi)膜樣腺癌作出初步篩查，但是誤診、漏診率較高。磁共振成像(MR)和腹部計算機斷層掃描(CT)對于判斷子宮內(nèi)膜樣腺癌的轉(zhuǎn)移具有較好的臨床價值。傳統(tǒng)的血液腫瘤標志物的整體綜合診斷性能不足，而診斷性刮宮和宮腔鏡下活檢是侵入性操作，易對患者的生理和心理產(chǎn)生影響，而且容易導(dǎo)致腫瘤的種植性轉(zhuǎn)移[3]。目前鮮有敏感而特異的無創(chuàng)篩查技術(shù)可用于子宮內(nèi)膜樣腺癌的早期診斷及分期預(yù)測。

液態(tài)活檢技術(shù)的發(fā)展及外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的發(fā)現(xiàn)為解決這一學(xué)科難題帶來了希望。CTC檢測具有無創(chuàng)性、綜合效能較高、早于影像學(xué)檢測和可重復(fù)性強等優(yōu)點。2010年以來，CTC的臨床價值陸續(xù)得到了國內(nèi)外眾多權(quán)威學(xué)會和指南的認可，應(yīng)用于多種癌癥的早期診斷、治療監(jiān)測、復(fù)發(fā)監(jiān)測和指導(dǎo)治療方案[4]。此外，DEGEZ等[5]研究發(fā)現(xiàn)，人附睪蛋白4(HE4)對子宮內(nèi)膜樣腺癌的早期篩查及分期預(yù)測可能有一定的參考價值。李小毛等[6]研究認為，術(shù)前糖類抗原199(CA199)檢測是預(yù)測子宮內(nèi)膜癌的病理高危因素和手術(shù)病理分期的良好指標。本研究旨在分析術(shù)前CTC、HE4、CA199聯(lián)合檢測在子宮內(nèi)膜樣腺癌篩查和分期預(yù)測中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2022年1月于中山大學(xué)腫瘤防治中心就診或體檢的293例子宮內(nèi)膜正常體檢者(正常組)、359例無非典型性子宮內(nèi)膜增生患者(良性組)、381例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者(惡性組)作為研究對象。正常組年齡24.5～82.6歲，平均(52.9±9.6)歲。良性組年齡22.7～81.2歲，平均(53.1±10.8)歲。惡性組年齡26.5～83.4歲，平均(53.5±11.6)歲。正常組、良性組和惡性組的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.28，P=0.76)。納入標準：年齡20～85歲；子宮內(nèi)膜為原發(fā)病灶；患者依從性好且病歷資料詳細；無孕激素拮抗的性激素治療史；未合并其他腫瘤。排除標準：妊娠期、哺乳期女性；有放化療、免疫治療史者；合并血液系統(tǒng)嚴重疾病者；精神疾病患者；因各種原因中途退出研究者。良性組、惡性組的病理診斷依據(jù)是2020年第5版世界衛(wèi)生組織推薦的子宮體癌分類標準[7]。采用2018年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟推薦的手術(shù)病理分期標準[8]，把惡性組381例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者分為Ⅰ期(261例)、Ⅱ期(41例)、Ⅲ期(43例)、Ⅳ期(36例)。陽性病例是經(jīng)病理學(xué)檢查確診為子宮內(nèi)膜樣腺癌的381例患者，陰性病例包括293例正常組受試者和359例良性組患者，共652例受試者。

1.2試劑與儀器 CTC檢測試劑盒和PathfinderTM全自動智能掃描圖像分析系統(tǒng)均購于江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司，HE4、CA199檢測試劑盒和Cobas E 801電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀均購于羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3方法 分別于正常組受試者體檢時、良性組和惡性組患者術(shù)前采集4.0 mL靜脈血液標本各2份。一份用于CTC檢測，另一份用于HE4、CA199水平檢測。(1)CTC檢測及結(jié)果判讀：按照CTC檢測說明書操作，采用“陰性富集法”以CS1緩沖液、CS2儲存液、CS3分離介質(zhì)和磁微粒混懸液，3 000 r/min離心8 min，離心半徑為15 cm，采用免疫磁微粒技術(shù)分離血漿、去除破裂紅細胞和白細胞，得到白細胞去除率大于99.99%、CTC回收率大于90%的細胞懸液。借助全自動智能掃描圖像分析系統(tǒng)，使用熒光原位雜交技術(shù)，排除其他的血源性細胞，鑒定細胞懸液中的CTC。CTC數(shù)量在0～1個為正常，判讀為陰性，CTC數(shù)量在2個及以上，判讀為陽性。(2)HE4、CA199檢測及結(jié)果判讀：按照HE4、CA199檢測說明書操作，血液標本以3 000 r/min離心8 min，取上層血清液，測定HE4、CA199水平。HE4參考范圍為0～140 pmol/L、CA199參考范圍為0～27 U/mL。HE4、CA199兩項指標檢測值大于參考范圍上限，定義為陽性。(3)CTC、HE4、CA199聯(lián)合檢測及結(jié)果判讀：聯(lián)合檢測組合結(jié)果判讀采用平行試驗，即CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199檢測結(jié)果中只要有一個試驗為陽性即診斷為該檢測組合陽性，全部試驗結(jié)果都為陰性時診斷為陰性。

2 結(jié) 果

2.13組CTC數(shù)量及HE4、CA199表達水平比較 3組CTC數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；惡性組CTC數(shù)量高于良性組和正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；良性組和正常組的CTC數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組HE4表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；惡性組HE4表達水平高于良性組和正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；良性組和正常組HE4表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3組CA199表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；惡性組CA199表達水平高于良性組和正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；良性組和正常組CA199表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組CTC數(shù)量及HE4、CA199表達水平比較[M(P25,P75)]

2.23組CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測陽性率比較 3組CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測陽性率總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。惡性組CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測陽性率高于良性組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；良性組和正常組HE4、CA199、CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測的陽性情況比較[n(%)]

2.3惡性組各分期的CTC數(shù)量及HE4、CA199表達水平比較 惡性組各分期CTC數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期CTC數(shù)量兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。惡性組各分期的HE4表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期、Ⅱ期與Ⅳ期、Ⅲ期與Ⅳ期HE4表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。惡性組各分期的CA199表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 惡性組各分期的CTC、HE4、CA199表達水平比較[M(P25,P75)]

2.4惡性組各分期CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測陽性率比較 惡性組各分期的CTC檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期CTC檢測陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。惡性組各分期HE4檢測陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.24，P=0.74)；惡性組各分期CA199檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期CA199檢測陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。惡性組各分期CTC+HE4檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期CTC+HE4檢測陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。惡性組各分期HE4+CA199檢測陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.52，P=0.68)。惡性組各分期CTC+CA199檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期CTC+CA199檢測陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。惡性組各分期CTC+HE4+CA199檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Ⅰ期與Ⅳ期CTC+HE4+CA199檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 惡性組各分期的CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測陽性率比較[n(%)]

2.5CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測對子宮內(nèi)膜樣腺癌的診斷效能 對單因素分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義的CTC、HE4、CA199檢測指標的原始值繪制相應(yīng)的ROC曲線，在擬合了CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199檢測的Logistic回歸模型后，使用其P值繪制相應(yīng)檢測的ROC曲線。ROC曲線分析結(jié)果顯示，CTC+HE4+CA199聯(lián)合檢測的曲線下面積(AUC)最大[0.945(95%CI：0.932～0.959)]，檢測靈敏度和特異度分別為87.93%、92.79%。CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測子宮內(nèi)膜樣腺癌的ROC曲線及相關(guān)參數(shù)見表5和圖1。

表5 CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測診斷子宮內(nèi)膜樣腺癌的ROC曲線相關(guān)參數(shù)

圖1 CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測診斷子宮內(nèi)膜樣腺癌的ROC曲線

3 討 論

近年來，子宮內(nèi)膜癌的病死率每年上升約1.4%，Ⅰ期患者5年生存率約90%，Ⅱ期約40%、Ⅲ期和Ⅳ期則降至20%以下[9]。因此，早期診斷有益于改善子宮內(nèi)膜樣腺癌患者生存率。CHU等[10]研究表明，CTC以不同形態(tài)存在于上皮細胞表型、間質(zhì)細胞表型，以及上皮細胞和間質(zhì)細胞混合表型。本研究中采用的檢測技術(shù)能高效進行CTC的鑒定，該技術(shù)不依賴CTC的理化特性，能有效將上皮細胞表型、間質(zhì)細胞表型及混合表型捕獲。本文與陳志強等[11-12]研究使用了相同的檢測技術(shù)。KISS等[13]研究表明，子宮內(nèi)膜癌患者中CTC的存在提示其總體生存率較差。本研究側(cè)重于探討CTC在子宮內(nèi)膜樣腺癌篩查和分期預(yù)測中的應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果顯示，3組CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而且惡性組CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測陽性率均高于良性組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；3組CTC數(shù)量及HE4、CA199表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，惡性組CTC數(shù)量及HE4、CA199表達水平均高于良性組和正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。本研究中，表1和表2通過單因素分析，甄選出了CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測中對惡性組篩查有統(tǒng)計學(xué)意義的檢測組合。這與TINGANELLI等[14]、DEGEZ等[5]、李小毛等[6]研究報道的結(jié)論基本一致。本研究聯(lián)合了CTC液態(tài)活檢技術(shù)與傳統(tǒng)的血液腫瘤標志物HE4和CA199這3項檢查指標。

本研究從檢測陽性率和表達水平兩個方面考察CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測對惡性組的分期預(yù)測價值，結(jié)果顯示CTC、CA199、CTC+HE4、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199檢測陽性率對于甄別惡性組各分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CTC數(shù)量及HE4表達水平對于甄別惡性組各分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中，表3和表4通過單因素分析甄選出了CTC、HE4、CA199單獨和聯(lián)合檢測中對惡性組分期具有預(yù)測價值的檢測組合。ZHANG等[15]檢測了78例Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌患者血液中的CTC，表明CTC對于子宮內(nèi)膜癌預(yù)后和轉(zhuǎn)移具有預(yù)測價值。ESPIAU等[16]研究認為，腫瘤標志物HE4可以預(yù)測子宮內(nèi)膜癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。AREND等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CA199對于提示子宮內(nèi)膜癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有一定的臨床意義。而本研究正常組和良性組Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期CA199差異的判斷與AREND等[17]研究結(jié)論有不同之處，可能是由于本文樣本量偏小引起的。本研究中，ROC曲線分析結(jié)果顯示，CTC+HE4+CA199檢測的AUC最大，靈敏度、符合率、約登指數(shù)等高于其他檢測組合。因此，CTC+HE4+CA199對子宮內(nèi)膜樣腺癌的綜合診斷價值較高。

由于受研究時間及樣本量的影響，本研究結(jié)論還需進一步驗證。本課題組今后將繼續(xù)加強與上級醫(yī)療機構(gòu)的合作，擴大樣本量，深入研究CTC、HE4、CA199與子宮內(nèi)膜樣腺癌的腫瘤分級、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分子分型等的相關(guān)性，更好地掌握子宮內(nèi)膜樣腺癌的特征和發(fā)生、發(fā)展機制，制訂個體化診治方案，造?；颊?。