陳雨晴，李 劍，靖小珍，姚文瑛△

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.實(shí)驗(yàn)中心，上海 201901

有研究顯示，大約15%的夫婦在無保護(hù)措施的性交1年后無法受孕[1]。在20%的不孕夫婦中，男性因素是唯一的原因，在另外30%～40%的不孕夫婦中，男性因素是促成因素[2]?；镜哪行圆挥Y評估需要全面的病史和精液分析，僅其中一項(xiàng)不能準(zhǔn)確區(qū)分不明原因的男性不育癥，因此，分子無創(chuàng)檢測可以為醫(yī)生提供有價(jià)值的信息，進(jìn)一步對不明原因的男性不育癥進(jìn)行評估和診斷[3]。此外，僅通過組織學(xué)工作評估睪丸組織標(biāo)本的傳統(tǒng)測試，在檢測和分類精子生成障礙方面的準(zhǔn)確性和敏感性都不高[4]。miRNA是一類短(20～23個(gè)核苷酸)的單鏈非編碼核苷酸，能夠通過mRNA降解或翻譯抑制來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5]。miRNA參與了各種生物過程，如增殖、分化、發(fā)育和凋亡[6]。有報(bào)道顯示，miRNA表達(dá)模式的改變與不同的人類睪丸組織病理學(xué)模式、生精功能障礙有關(guān)[7]。因此，精液miRNA可以作為評估人類男性生育狀況的特定生物標(biāo)志物?；诖?，本研究通過高通量測序檢測精液中miRNA表達(dá)水平，探討精液中miRNA表達(dá)水平對男性不育癥的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2019年4月至2021年4月本院收治的168例男性不育癥患者，其中20例通過高通量測序分析其精液中miRNA表達(dá)水平，年齡23～39歲，平均(32.45±6.23)歲；另外148例為研究組，年齡22～41歲，平均(32.54±5.29)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)采集精液前接受任何治療的患者；(2)腫瘤患者；(3)全身性自身免疫性疾病患者；(4)嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；(5)長期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者；(6)有明確的生殖器外傷史、感染史者。同時(shí)納入在本院體檢的168例男性健康志愿者，其中20例用于高通量測序分析miRNA表達(dá)水平，年齡22～39歲，平均(33.26±8.01)歲；另外148例作為對照組，年齡21～42歲，平均(32.69±5.31)歲。各組年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得受試者知情同意及本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法 所有受試者收集精液前禁欲2～7 d，手淫法采集第一次射出的精液作為標(biāo)本。使用Trizol法抽取168例男性不育癥患者和168例男性健康志愿者精液中的miRNA，其中20例健康志愿者與20例男性不育癥患者精液用于miRNA高通量測序(北京諾禾致源科技股份有限公司)，148例健康志愿者148例男性不育癥患者精液用于本研究其他分析。miR-34b、miR-122、miR-429引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。miR-34b的引物序列：上游引物為5′-TGCGGTCAATCACTAACTCC-3′，下游引物為5′-CGTGCAGGGTCCGAGGT-3′; miR-122的引物序列：上游引物為5′-GCCGTGGAGTGTGACAATGGT-3′，下游引物為 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′; miR-429的引物序列：上游引物為5′- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG-3′，下游引物為 5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。采用北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(貨號：DEM202-200T)和ABI7500儀器進(jìn)行qPCR。參考說明書設(shè)置反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min(預(yù)變性)，然后94 ℃ 15 s(變性)，55 ℃ 30 s(退火)，70 ℃ 30 s(延伸)，共40個(gè)循環(huán)，繪制最終熔解曲線。miRNA的相對表達(dá)水平由公式2-ΔΔCt計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.120例健康志愿者與20例男性不育癥患者精液中miR-34b、miR-122、miR-429的表達(dá)水平 高通量測序發(fā)現(xiàn)，20例健康志愿者與20例男性不育癥患者精液中多種miRNA的表達(dá)水平有一定差異，其中表達(dá)上調(diào)的miRNA有58個(gè)、表達(dá)下調(diào)的miRNA有22個(gè)，見圖1。選取測序結(jié)果表達(dá)水平差異最大的10個(gè)miRNA，并且使用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組受試者精液中miR-34b、miR-122、miR-429的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 20例健康志愿者與20例男性不育癥患者精液中多種miRNA的表達(dá)情況

表1 兩組受試者精液中miR-34b、miR-122、miR-429相對表達(dá)水平比較

2.2精液中miR-34b、miR-122、miR-429檢測對男性不育癥的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，miR-34b、miR-122、miR-429單獨(dú)診斷男性不育癥的靈敏度和特異度見表2。

表2 精液中miR-34b、miR-122、miR-429診斷男性不育癥的ROC曲線相關(guān)參數(shù)

2.3精液中miR-34b、miR-122、miR-429對男性不育癥的聯(lián)合診斷 患有男性不育癥的為真陽性，未患男性不育癥的為真陰性。miR-34b的陽性臨界值為0.460 5，miR-122的陽性臨界值為0.586 6，miR-429的陽性臨界值為0.667 7，以三者之一陽性為聯(lián)合診斷陽性，反之則為聯(lián)合診斷陰性。精液中miR-34b、miR-122、miR-429聯(lián)合對男性不育癥的診斷的靈敏度為96.62%(143/148)，特異度為91.22%(135/148)，準(zhǔn)確度為93.92%(278/296)。

3 討 論

目前，精液中還沒有可靠的分子標(biāo)志物用于男性不育癥的伴隨診斷[8]，在睪丸活檢評估中也缺乏用于常規(guī)組織學(xué)診斷的標(biāo)志物[9]，而具有不同精液和組織病理學(xué)損傷的患者中miRNA 表達(dá)譜的改變可能為診斷提供新的生物標(biāo)志物[10]。本研究旨在分析臨床上可用于評估男性生育狀態(tài)的miRNA生物標(biāo)志物。除了作為生物標(biāo)志物的潛力外，miRNA在精子發(fā)生過程中的生物學(xué)作用也越來越得到認(rèn)可。有研究已在雄性生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞中鑒定出許多睪丸特異性miRNA，其中一些 miRNA在精子發(fā)生的減數(shù)分裂后期高度表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，男性不育癥患者與健康志愿者精液中miR-34b、miR-122、miR-429的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。精液中miR-34b、miR-122、miR-429單向診斷男性不育不孕的靈敏度分別為91.89%、93.92%、92.57%，特異度分別為93.24%、94.59%、93.24%。與青春期前睪丸相比，miR-34b 在成人睪丸中高度表達(dá)，表明其在雄性生殖細(xì)胞分化中的潛在作用[12-13]。類似地，miR-122 主要在減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞中表達(dá)并抑制過渡蛋白2的轉(zhuǎn)錄。過渡蛋白2是一種睪丸特異性蛋白，參與精子發(fā)生過程中的染色質(zhì)重塑[14-15]。這些研究表明，鑒定出的 miRNA 不僅可以作為潛在的生物標(biāo)志物，而且其可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。更好地了解已鑒定的miRNA 的生物學(xué)作用將有助于提高其作為生物標(biāo)志物的價(jià)值。除了miR-34b、miR-122、miR-429，本研究發(fā)現(xiàn)的健康志愿者與男性不育癥患者精液中其他差異miRNA在男性不育癥中的作用值得進(jìn)一步探索。

綜上所述，精液中miR-34b、miR-122、miR-429可作為男性不育癥的潛在生物標(biāo)志物。