劉嘉藝, 岳俊陽, 劉永勝

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

根據(jù)獼猴桃屬植物分類學(xué)最新修訂,該屬植物全世界有54個(gè)種、21 個(gè)變種,共約75個(gè)分類單元,中國(guó)分布有52個(gè)種,其中有44個(gè)種為中國(guó)特有[1],獼猴桃遺傳資源非常豐富,對(duì)于其開發(fā)利用有著天然的優(yōu)勢(shì)。獼猴桃原是一種古老藤本果樹上的野果, 19世紀(jì)初被引種至新西蘭,逐漸發(fā)展成為一種風(fēng)靡全球的水果。獼猴桃含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,富含維生素C、多種礦質(zhì)、氨基酸,有“水果之王”的美譽(yù)[2]。

獼猴桃作為顯花雌雄異株果樹,對(duì)其早期性別鑒定的研究在實(shí)踐中有著非常重要的意義。首先,獼猴桃是以果實(shí)為主的經(jīng)濟(jì)作物,雌株的經(jīng)濟(jì)價(jià)值明顯高于雄株;其次,由于獼猴桃從播種到多產(chǎn)的成熟期經(jīng)歷時(shí)間較長(zhǎng),需要3～5 a,童期漫長(zhǎng)和幼苗期雌雄無法辨別,是獼猴桃改良和選育道路上的一個(gè)巨大阻礙[3]。因此,開發(fā)用于獼猴桃早期性別鑒定的技術(shù)或分子標(biāo)記可以有效地控制栽培過程中的雌雄比例,減少不必要的生產(chǎn)浪費(fèi),提高育種效率,創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

近年來,分子標(biāo)記技術(shù)作為分析遺傳變異的有效工具被應(yīng)用廣泛。分子標(biāo)記包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)等,這些技術(shù)先后用于獼猴桃早期性別分析,在果樹童期進(jìn)行雌雄選株提供了可靠的技術(shù)方法[4-5]。隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展以及測(cè)序成本的不斷降低,在許多物種的研究上產(chǎn)生了豐富的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的EST數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析得到的微衛(wèi)星序列已成為分子標(biāo)記技術(shù)使用的重點(diǎn),且在花椒、洋蔥、蘑菇等物種上得到成功驗(yàn)證[6-8]。微衛(wèi)星序列又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR),是重復(fù)序列的主要組成成分之一。SSR是一類由 1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位序列組成的串聯(lián)重復(fù)序列[9]。SSR為共顯性標(biāo)記,能區(qū)分純合子和雜合子,能檢測(cè)出等位基因,較簡(jiǎn)單、快捷、低成本,效率更高更經(jīng)濟(jì)。

近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)SSR技術(shù)應(yīng)用于獼猴桃進(jìn)行了一些研究。文獻(xiàn)[10]報(bào)道了在雜交后代中符合孟德爾遺傳定律分離的40對(duì)SSR引物,并以二倍體和四倍體的中華獼猴桃作為研究對(duì)象,討論其雜合程度;文獻(xiàn)[11]將文獻(xiàn)[10]報(bào)道的引物應(yīng)用于我國(guó)栽培的中華獼猴桃和美味獼猴桃2個(gè)商業(yè)物種的9個(gè)天然居群(共221個(gè)樣),對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行初步分析;文獻(xiàn)[12-13]均通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)EST數(shù)據(jù)庫的軟棗獼猴桃EST序列開發(fā)了若干對(duì)在獼猴桃屬種有著較高通用性的EST-SSR引物;本課題組對(duì)中華獼猴桃“紅陽”的轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行分析,根據(jù)分析結(jié)果開發(fā)了EST-SSR引物,并對(duì)28個(gè)品種的獼猴桃進(jìn)行遺傳多樣性分析[14]。大多數(shù)報(bào)道的獼猴桃SSR分子標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用均使用來自于EST數(shù)據(jù)庫的序列、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析或者直接采用已公布的SSR引物來進(jìn)行生物信息學(xué)分析和遺傳多態(tài)性的實(shí)驗(yàn),但用于性別鑒定的SSR引物并不多。

本研究進(jìn)行SSR性別鑒定位點(diǎn)篩選所用的基因組序列為毛花獼猴桃(A.eriantha)雄雌基因組數(shù)據(jù)[15]。通過對(duì)獼猴桃雄雌基因組的29條染色體進(jìn)行篩選獲得SSR標(biāo)記,對(duì)SSR位點(diǎn)的組成、分布及特征進(jìn)行分析,開發(fā)可以有效鑒定毛花獼猴桃雄雌植株的SSR引物,以期為毛花獼猴桃幼苗期性別鑒定、毛花獼猴桃性別相關(guān)基因的克隆提供依據(jù),并為其轉(zhuǎn)化和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于本研究的毛花獼猴桃樣品于2020年7月采集,雄株5株,雌株2株,人工栽培于安徽省合肥市蜀山區(qū)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)萃園。選取植株上的幼嫩葉片,作為提取基因組DNA的供試材料,采下后放置于冰盒中,立即帶回實(shí)驗(yàn)室經(jīng)液氮處理后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組數(shù)據(jù)及SSR位點(diǎn)識(shí)別定位

利用MISA(http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具對(duì)毛花獼猴桃基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR位點(diǎn)的識(shí)別定位。篩選標(biāo)準(zhǔn)如下:單核苷酸重復(fù)的次數(shù)在10次或10次以上;二核苷酸重復(fù)的次數(shù)在6次或6次以上;三至六核苷酸重復(fù)的次數(shù)在5次或5次以上。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

利用Primer 3.0對(duì)篩選得到的SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,引物設(shè)計(jì)原則為:引物序列長(zhǎng)度18～22 bp, 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物長(zhǎng)度100～300 bp,退火溫度50～63 ℃, GC占比為40%～60%,盡量避免出現(xiàn)錯(cuò)配、二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體。最終隨機(jī)合成150對(duì)引物,將引物序列送生工生物工程上海有限公司合成,部分引物信息見表l所列。

基于小流域河（溝）道生態(tài)監(jiān)測(cè)的必要性和緊迫性，本研究借鑒歐盟水框架的理念與方法，選擇典型河（溝）道開展生態(tài)監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)的研究探索，為摸清北京市河（溝）道生態(tài)質(zhì)量、實(shí)行分類和指導(dǎo)治理奠定基礎(chǔ)，服務(wù)于北京的水資源和生態(tài)環(huán)境保護(hù)。

表1 SSR引物序列

1.2.3 獼猴桃基因組DNA的提取

采用改良后的CTAB方法提取毛花獼猴桃新鮮幼嫩葉片總DNA,提取后的DNA經(jīng)NanoDrop 2000測(cè)定質(zhì)量濃度,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

本研究所用的普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系,總體積為10 μL,其中Taq Mix 8.4 μL,DNA模板1.0 μL,正反向引物各為0.3 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、根據(jù)實(shí)際溫度退火30 s、72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃完全反應(yīng)10 min,最后在4 ℃下保存。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè),電泳凝膠配方為：蒸餾水8 mL,30%丙烯酰胺4 mL,5×TBE溶液3 mL,10%APS溶液100 μL,四甲基乙二胺10 μL。電泳后使用紫外核酸檢測(cè)儀成像。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 SSR位點(diǎn)數(shù)量與分布

利用MISA工具對(duì)毛花獼猴桃的雄雌基因組序列進(jìn)行識(shí)別,在29條染色體和1條未匹配序列共計(jì)30條序列中,總長(zhǎng)690 378 758 bp, 共識(shí)別出381 250個(gè)符合條件的SSR位點(diǎn),每條序列都含有1個(gè)以上的SSR位點(diǎn)。

毛花獼猴桃基因組的SSR種類非常豐富,各種重復(fù)類型均有出現(xiàn),但是其數(shù)量有很大差異,見表2所列。由表2可知,單核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量最多,占比50.74%;其次是二核苷酸重復(fù)類型,占比39.82%;然后是三核苷酸重復(fù);五核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量最少,占比不到0.6%。

表2 毛花獼猴桃基因組SSR類型和比例

表3 毛花獼猴桃基因組SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)分布

2.2 SSR位點(diǎn)的分布特征

毛花獼猴桃SSR核苷酸基序類型見表4所列。從表4可以看出,SSR以單核苷酸重復(fù)基序?yàn)橹饕愋?有193 459次;其次是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型。在單核苷酸重復(fù)基序中以A/T為主,有187 077次,占總單核苷酸重復(fù)的96.7%,以重復(fù)10次為主;在二核苷酸重復(fù)基序中以AG/CT為主,有85 326次,占總二核苷酸重復(fù)的56.2%,以重復(fù)6次為主;在三核苷酸重復(fù)基序中以AAT/ATT為主,有6 134次,占總?cè)塑账嶂貜?fù)的24.6%,以重復(fù)5次為主。

表4 毛花獼猴桃雄雌基因組中的SSR類型分布

2.3 SSR性別特異片段的篩選

利用150對(duì)特異引物對(duì)毛花獼猴桃雌雄植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示:在150對(duì)特異引物中,有117對(duì)引物擴(kuò)增出性別特異產(chǎn)物,但是多數(shù)引物特異性較差,多態(tài)性強(qiáng),擴(kuò)增出的條帶數(shù)目多。其中一對(duì)引物(序號(hào)為Primer000181)在雌雄個(gè)體上出現(xiàn)差異,在雄性植株中擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度為250 bp的特異性片段,在雌株中沒有擴(kuò)增出特異性片段,如圖1所示。圖1中:1～10個(gè)泳道分別為引物Primer000041、Primer000066、Primer000161、Primer000181、Primer000196用毛花獼猴桃雄株和雌株基因組DNA作為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物;M表示DNA marker,m表示雄性;f表示雌性，下同。

引物Primer000161和Primer000181在7株已知性別毛花獼猴桃植株中的通用性鑒定如圖2所示。從圖2可以看出，Primer000161在7個(gè)模板中沒有表現(xiàn)出和初篩結(jié)果相似的性別特異,因此不能作為性別鑒定引物;而Primer000181在5株雄株中有一條特異性片段,2株雌株中沒有擴(kuò)增出特異性片段,與初篩結(jié)果一致。該結(jié)果用同樣的方法重復(fù)3次,得到同樣的結(jié)果,說明該標(biāo)記穩(wěn)定、可靠。

圖1 引物篩選的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2 引物Primer000161和Primer000181的通用性鑒定

3 討 論

獼猴桃作為雌雄異株植物,在育苗期對(duì)其進(jìn)行性別鑒定具有重要的生物學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于雌株和雄株會(huì)在生理生化、蛋白質(zhì)與核酸等方面體現(xiàn)出差異,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,性別鑒定的方法也非常廣泛。目前形態(tài)學(xué)鑒定方法、性別特異蛋白的研究以及DNA分子標(biāo)記法應(yīng)用較多。DNA分子標(biāo)記是DNA水平遺傳變異的直接反應(yīng),由于結(jié)果更為穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn),SSR已成為目前分子標(biāo)記研究中的主要形式,在山楊、海棗等植物中都有過SSR性別分子標(biāo)記的報(bào)道[16-17]。

本研究通過對(duì)比毛花獼猴桃雌雄基因組序列,分析SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布特征,通過PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法篩選特異性引物,從而獲得理想的SSR性別分子標(biāo)記,即Primer000181。Primer000181在Chr19染色體,位置為186948 187203,附近有Glycosyltransferase family 90 protein、Outer dense fiber protein等功能基因,為后續(xù)毛花獼猴桃性別決定機(jī)制研究奠定基礎(chǔ),該SSR引物帶結(jié)果清晰、特異性高,為毛花獼猴桃雌雄植株的早期性別鑒定提供了技術(shù)保障。