吳計松，吳 驍，鄭家雷，高振遠

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233000)

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，最近的全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2020年世界范圍新發(fā)食管癌病例為604 100例，相關死亡人數(shù)為544 076例，分別位于最常見癌癥發(fā)病率和病死率的第7位和第6位[1]。根據(jù)最新發(fā)表的2019中國癌癥年報[2]，中國新確診食管癌病例數(shù)為278 121例，為最常見癌癥發(fā)病率的第6位；食管癌相關死亡人數(shù)為257 316例，位居第4位。食管癌患者以男性為主,占70%，男女發(fā)病率為2～3比1[1]。食管癌的病理類型主要有兩種：食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)，其中鱗狀細胞癌占95%以上。有研究[3]發(fā)現(xiàn),食管癌的發(fā)生主要與不良的飲食習慣、經(jīng)濟社會地位低下、常吃粗糧、喜好吸煙和飲酒、新鮮蔬菜水果攝入不足等有關。食管癌預后較整體預后差，5 a生存率低于25%[4]。食管癌發(fā)病機制復雜，分子機制尚不清楚。盡管最近在早期診斷和治療方面取得了進展，但預后仍然不盡如人意。因此，迫切需要新的有效治療方法，進一步提高臨床治療效果。

本研究通過檢測血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)在ESCC組織中的表達及與臨床病理特征的關系，探討針對VEGFR2的靶向藥物安羅替尼(Anlotinib)聯(lián)合紫杉醇對食管癌ECA-109細胞的增殖、侵襲和遷移、凋亡的影響及可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2019年1月—2020年12月蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院手術切除的50例ESCC組織及相對應的距離癌組織2 cm以上的癌旁組織臨床標本。排除術前接受免疫治療、化療或放療的患者。在收集和使用臨床標本之前，每位患者均簽署知情同意書。本研究涉及的臨床標本協(xié)議由蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會授權。VEGFR2、過氧化物酶聯(lián)合二抗試劑盒購自Abcam公司，人食管癌細胞株ECA-109細胞購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司。胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基購于Gibco公司。Anlotinib購自南京正大天晴制藥有限公司，紫杉醇購自山東齊魯制藥有限公司。一抗磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)購自上海任捷生物科技有限公司，B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2-Associated X的蛋白質(Bax)試劑盒和二抗購于Abcam 公司。CCK8 試劑盒、凋亡檢測試劑盒和 ECL 發(fā)光試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司。Transwell試劑盒購自Corning中國公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 首先將石蠟切片脫蠟至水，用質量分數(shù)3%H2O2室溫孵育 5 min，蒸餾水沖洗，然后PBS緩沖液浸泡各5 min，共2次，應用質量分數(shù)5%～10% 正常山羊血清(PBS緩沖液稀釋)封閉后，室溫下孵育10 min，加入VEGFR2一抗(ab2349,Abcam)孵育，4 ℃過夜。PBS緩沖液沖洗，5 min×3次。用過氧化物酶聯(lián)合二抗(ab7090,Abcam)孵育。顯色劑顯色 3～15 min，然后依次自來水充分沖洗、復染、脫水、透明及封片。在200倍光鏡下評價VEGFR-2染色。人工評分染色強度:無染色=0，弱染色=1，中等染色=2，強染色=3。隨機選取5個視野中的腫瘤細胞進行評分，得到陽性細胞的平均百分率(0～100%)。0～5%得分0，6%～35%得分1，36%～70%得分2，>70%得分3。最終免疫組化評分按陽性細胞分數(shù)×染色強度分數(shù)分為低表達組和高表達組：低表達組為總分<4分，高表達組為總分≥4分，在癌旁組織無表達為陰性表達組。

1.2.2 細胞培養(yǎng) ECA-109細胞在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下的濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用含質量分數(shù)10%的胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的ECA-109細胞，待細胞生長至90% 融合度時，棄掉培養(yǎng)基，PBS緩沖液反復清洗2遍，質量分數(shù)0.25% 胰酶-EDTA消化傳代。

1.2.3 CCK8法測定細胞活力 收集呈對數(shù)期穩(wěn)定生長的ECA-109細胞，使用細胞計數(shù)板計數(shù)，調整細胞懸液濃度至5×104mL-1，向96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，細胞貼壁生長后，Anlotinib濃度梯度依次設置為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol·L-1，每個濃度再設4個復孔，每個復孔加入100 μL不同濃度的Anlotinib。在37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基，避光，37 ℃培養(yǎng)箱中再孵育2 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度。紫杉醇單獨作用24 h的抑制率(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol·L-1)和Anlotinib(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol·L-1)聯(lián)合紫杉醇作用24 h(0、4、4、4、4、4、4、4 μmol·L-1)的抑制率在ECA-109細胞中是由相同的方法測得。

1.2.4 細胞凋亡實驗 在6孔板中接種ECA-109細胞，加入完全培養(yǎng)基，待細胞匯合率為70%～80% 時，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，將各孔設置為對照組、Anlotinib處理組(0、4、8、16 μmol·L-1)、Anlotinib(0、4、8、16 μmol·L-1)聯(lián)合紫杉醇(4 μmol·L-1)處理組，各組分別加入不同濃度藥物2 mL，37 ℃、體積分數(shù)5% CO2孵育24 h。收集5×105個細胞于流式管中，用預冷的PBS緩沖液清洗細胞，1 000 rpm離心8 min，移除上清液，加入200 μL 1×Binding Buffer重懸細胞和3 μL Annexin V-FITC，冰上孵育15 min后加入5 μL PI Staining Solution，輕輕震蕩混勻，避光、室溫反應10 min；再加入200 μL 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 在Transwell上室內(nèi)加入50 μL基質膠,置于37 ℃ 恒溫箱中30 min。收集ECA-109細胞，使用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將Anlotinib(0、4、8、16 μmol·L-1)，Anlotinib(0、4、8、16 μmol·L-1)聯(lián)合紫杉醇(0、4、4、4、4 μmol·L-1)的2×105mL-1濃度細胞懸液。分別取100 μL加入上室，下室加入含質量分數(shù)10% 胎牛血清的培養(yǎng)液600 μL，每組設置2個復孔，實驗重復3次;培養(yǎng)48 h后取出Transwell 小室，沖洗后用棉簽輕輕擦去微孔膜上層細胞;用質量分數(shù)4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，結晶紫室溫染色20 min。光學倒置顯微鏡下(×100) 計數(shù)侵襲至微孔膜下層的細胞，每個樣本選取5個視野，取平均值。

1.2.6 Transwell遷移實驗 在Transwell上室內(nèi)不用鋪設基質膠，其余步驟同侵襲實驗方法。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測ECA-109細胞p-mTOR、p-AKT、p-VEGFR2、Bcl-2、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表達 將ECA-109細胞接種至100 mm培養(yǎng)皿中，當細胞融合度為70%～80%時，加入不同濃度藥物處理Anlotinib(0、4、4、8、16 μmol·L-1)聯(lián)合紫杉醇(4、4、4、4 μmol·L-1)處理，24 h后提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，充分混合均勻，96 ℃ 加熱5 min。每種樣品取終濃度30 μg上樣電泳，轉移至PVDF膜，快速封閉液封閉20 min。按照不同分子量剪切PVDF膜，加入對應的抗體，4 ℃搖床孵育12 h。再用TBST室溫清洗3次，每次5 min，加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，顯色曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 ESCC中VEGFR2的表達與臨床病理特征的關系 50例ESCC及癌旁組織進行檢測，根據(jù)染色強度，將ESCC標本分為VEGFR2高表達組和低表達組。見圖1。ESCC組織中VEGFR2表達較癌旁正常組織明顯升高(P<0.05)。見表1。并且VEGFR2的表達與性別、年齡、部位、組織學分級、淋巴結轉移無關(P>0.05)，與TNM分期有關(P<0.05)。見表2。

注：A.VEGFR2在癌旁組織中的表達；B.VEGFR2在腫瘤組織中的低表達；C.VEGFR2在腫瘤組織中的高表達。

表1 VEGFR2在ESCC和癌旁正常組織中的表達(n)

表2 ESCC中VEGFR2的表達與臨床病理特征的關系(n)

2.2 Anlotinib、Anlotinib聯(lián)合紫杉醇對ECA-109細胞增殖的影響 CCK8結果顯示，隨著Anlotinib藥物濃度的增加,ECA-109細胞增殖活性明顯降低。聯(lián)合組較單藥組對ECA-109細胞增殖活性的抑制率更高。見圖2。

圖2 紫杉醇(4 μmol·L-1)聯(lián)合不同濃度Anlotinib(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol·L-1) 對ECA-109細胞增殖能力的影響

2.3 Anlotinib、Anlotinib聯(lián)合紫杉醇對ECA-109細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測凋亡顯示，聯(lián)合組較單藥組細胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3(A、B、C、D)。

注：與對照組比較，高濃度Anlotinib處理組細胞凋亡明顯增加(P<0.05)。與紫杉醇聯(lián)合用藥后，凋亡顯著增加(P<0.05)。

2.4 Anlotinib、Anlotinib聯(lián)合紫杉醇對ECA-109細胞侵襲和遷移的影響 與對照組比較，各治療組ECA-109細胞的侵襲抑制率隨藥物濃度的增加而顯著升高。見圖4(A、B)。

注：A.Anlotinib對ECA-109細胞的侵襲遷移的抑制隨藥物濃度的增加而顯著升高；B.Anlotinib聯(lián)合紫杉醇可進一步抑制ECA-109細胞的侵襲和遷移。

2.5 Anlotinib聯(lián)合紫杉醇對ECA-109細胞p-mTOR、p-AKT、p-VEGFR2、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的影響 Western blotting結果顯示，不同濃度的Anlotinib聯(lián)合紫杉醇作用ECA-109細胞，p-mTOR、p-AKT、p-VEGFR2和Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)，Active Caspase-3和Bax蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖5(A、B)。

注：A.Western blotting記錄圖；B.相對表達量；**:與對照組比較，P<0.05。

3 討論

ESCC是一種常見的消化道腫瘤,是世界上最具侵襲性的惡性腫瘤之一，迄今為止，手術、放療和化療仍然是主要的治療方法。食管癌惡性程度高，發(fā)展迅速，治療效果差，復發(fā)和轉移率高，據(jù)統(tǒng)計2010—2014年美國人群凈食管癌生存率僅為20.0%[5]。由于許多患者確診時多為晚期，ESCC預后很差?；熞恢笔寝D移性食管癌的主要治療手段，許多單一化療藥物抗腫瘤活性較差，如5-氟尿嘧啶(5-FU)和順鉑，單藥有效率僅為6%～17%，中位總生存率為3～7個月。紫杉醇在ESCC中被證明有很高的有效率并且與鉑類衍生物有很好的協(xié)同作用，然而其單藥有效率僅15%，中位無進展生存時間為25周，中位總生存時間為39周[6]。因此，需要進一步研究來確定其發(fā)病機制，探尋食管癌新的治療方法。

近年來，靶向治療得到了廣泛的應用，引起了廣泛關注，與細胞毒性藥物相比，分子靶向藥物具有不良反應少、給藥方便、安全可靠、良好的忍受力等優(yōu)點，其中抗血管生成藥物已成為研究熱點之一[7]。新生血管的形成是癌癥增殖和生長過程中一個關鍵因素。VEGF是參與腫瘤血管生成的關鍵促生成因子之一，食管癌術后病理顯示，VEGF在30%～60%的患者中出現(xiàn)過表達，并且與臨床分期和預后不良有關。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子(PlGF)，與不同的VEGF受體結合(VEGFRs)并發(fā)揮多種生物學功能。VEGFR2主要表達于內(nèi)皮細胞，是一種酪氨酸激酶受體,VEGFR-2過表達不僅可以促進血管生成，而且還能促進細胞有絲分裂[8]。因此，VEGFR-2表達增加在腫瘤新生血管形成中起著至關重要的作用[9]。VEGF特異性結合VEGFR-2，VEGFR-2被激活，誘導一系列信號轉導反應，促進腫瘤細胞生長、增殖和遷移[10]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，VEGFR2在ESCC中的高表達率為38%(19/50),在癌旁組織中僅2例高表達4%(2/50),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),另外，VEGFR2高表達與TNM分期呈正相關(P<0.05)，提示VEGFR2是ESCC預后不良因素,因此，通過抗VEGFR2治療是治療ESCC的重要策略[11]。

Anlotinib是一種新型口服酪氨酸激酶受體抑制劑，靶向抑制VEGFR-2和VEGFR-3、成纖維細胞生長因子受體1-4(FGFR1-4)、血小板衍生生長因子受體α和β(PDGFR-α和PDGFR-β)、干細胞生長因子(c-Kit)和Ret[12]。有研究[13]表明，Anlotinib抑制腫瘤發(fā)展主要是通過對VEGFR2的強特異性抑制，具有抗血管生成和廣譜抗腫瘤活性。已經(jīng)批準用于既往至少接受過2種系統(tǒng)化療后復發(fā)或進展的局部晚期或轉移性非小細胞型肺癌患者、既往至少接受過2種化療方案治療后進展或復發(fā)的小細胞肺癌患者和軟組織肉瘤(腺泡狀軟組織肉瘤、透明細胞肉瘤及既往至少接受過含蒽環(huán)類化療方案治療后進展或復發(fā)的其他晚期軟組織肉瘤患者)，另外，在腎細胞癌、肝細胞癌、卵巢癌、ESCC、胃癌、大腸癌、鼻咽癌和甲狀腺癌的臨床研究正在進行中。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，Anlotinib聯(lián)合紫杉醇較Anlotinib單藥顯著抑制ECA-109細胞的增殖、侵襲和遷移并促進了細胞凋亡(P<0.05)；并且隨著Anlotinib濃度的升高對ECA-109細胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響逐漸增強，由此推測Anlotinib可能對紫杉醇的療效起增敏作用。

AKT/mTOR信號路徑是腫瘤細胞主要的生存通路之一，有證據(jù)[14]表明，AKT/mTOR信號路徑控制著許多關鍵的細胞過程，如代謝、運動、生長、增殖、分化、侵襲和轉移。作為一個VEGFR的下游目標，AKT/mTOR信號通路已成為癌癥領域靶向治療的重點[15-16]。本研究通過Western blotting檢測Anlotinib聯(lián)合紫杉醇處理后ECA-109細胞中p-mTOR、p-AKT、p-VEGFR2、Bcl2、Bax、Caspase-3蛋白的表達。p-mTOR、p-AKT、p-VEGFR2、Bcl2蛋白表達水平顯著降低，Active Caspase-3和Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Anlotinib可能通過VEGFR2依賴的AKT/mTOR途徑，從而抑制ECA-109細胞的增殖、侵襲和遷移，促進其凋亡。

綜上所述，Anlotinib聯(lián)合紫杉醇抑制VEGFR2 的表達，抑制增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡，進而提高食管癌細胞對紫杉醇敏感性。盡管Anlotinib增強食管癌細胞對紫杉醇的敏感性的詳細作用機制仍需進一步研究，但兩藥聯(lián)合對食管癌治療提供了新的理論依據(jù)。