梁偉華 蔣 淼 李建玲 許方方

[上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院寶山分院)麻醉科，上海市 200431]

丙泊酚是臨床上腫瘤切除手術(shù)中常用的麻醉藥，具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、止吐等功能[1]。近年有研究顯示，丙泊酚還具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[2]。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，丙泊酚可抑制乳腺癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和新生血管形成，但是丙泊酚影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的機(jī)制尚不清楚[3-5]。Wnt信號(hào)通路是一個(gè)在生物進(jìn)化過程中比較重要的信號(hào)通路[6]。研究顯示，Wnt信號(hào)通路與丙泊酚的抗腫瘤機(jī)制有關(guān)，丙泊酚可以通過降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等的Wnt信號(hào)通路的活化程度，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞惡性表型的作用[7-8]。本研究以胃癌SGC7901細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討丙泊酚對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制，以期為丙泊酚抗腫瘤機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 丙泊酚購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司(批號(hào)：JKG8628)；DMEM購(gòu)自江蘇齊氏生物科技有限公司(批號(hào)：3-2010)；細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體、C-myc抗體、二甲基亞砜均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司(批號(hào)：SAB4700958、C7464、D2650)；MTT溶液(批號(hào)：SH-0163)、Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)(批號(hào)：SOS-174)試劑盒均購(gòu)自北京凱詩(shī)源生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào)：SPL-37524)；兔抗活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗體、鼠抗GAPDH抗體、山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(批號(hào)：ab2302、ab205718、ab8245、ab205719)；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司(批號(hào)：sc-7963)；Wnt激活劑氯化鋰(LiCl)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司(批號(hào)：M00507-NES)；PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司(批號(hào)：KGA511)；RIPA裂解液(貨號(hào)：R0020-100)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胃癌SGC7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Labsystems 公司；BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 MTT法測(cè)定胃癌細(xì)胞增殖情況 采用DMEM，并置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種到96孔板內(nèi)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過夜，吸棄上清，然后分別添加含有0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL丙泊酚的DMEM 100 μL(將0 μg/mL丙泊酚處理組記為空白組)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔添加MTT溶液15 μL，孵育4 h，棄去上清，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度值，以吸光度值表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞分組與處理 采用DMEM，并置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種到96孔板內(nèi)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、丙泊酚組、干預(yù)組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。(1)對(duì)照組添加含有0 μg/mL丙泊酚的DMEM 100 μL；(2)丙泊酚組添加含有15 μg/mL丙泊酚的DMEM 100 μL；(3)干預(yù)組添加含有15 μg/mL丙泊酚和20 mmol/L Wnt激活劑LiCl[9]的DMEM 100 μL。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 PI單染法測(cè)定胃癌細(xì)胞周期 取1.3處理后的各組細(xì)胞，用0.25%胰酶充分消化后，PBS洗滌5 min，然后4 ℃下2 000 r/min離心5 min，棄上清取細(xì)胞沉淀，加入500 μL的70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃冰箱過夜；然后用PBS洗滌5 min，4 ℃下2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min，加入400 μL PI染液，4 ℃避光反應(yīng)20 min。流式細(xì)胞儀測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm處的紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況，采用MultiCycle軟件分析細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法測(cè)定胃癌細(xì)胞凋亡情況 取1.3處理后的各組細(xì)胞，用0.25%胰酶充分消化后，以預(yù)冷的PBS將洗滌3次，每次5 min，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸后收集細(xì)胞，制成106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液后加入10 μL的Annexin Ⅴ-FITC混合均勻，室溫避光孵育10 min，再加入10 μL PI染液混合均勻，室溫避光孵育5 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率(%)=(早期凋亡數(shù)+晚期凋亡數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100 %。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot測(cè)定cleaved Caspase-3、cyclin D1、C-myc、β-catenin蛋白表達(dá)量 收集1.3處理后的對(duì)照組、丙泊酚組、干預(yù)組細(xì)胞，用0.25%胰酶充分消化后獲取細(xì)胞，采用RIPA試劑盒提取細(xì)胞的總蛋白，采用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。行10% SDS-PAGE，然后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜放在5%脫脂奶粉溶液中孵育1 h，再置于TBST溶液中洗滌2次，5 min/次；以GAPDH為內(nèi)參，將膜依次放在一抗(cleaved Caspase-3、cyclin D1、β-catenin、C-myc，稀釋比均為1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST溶液中洗滌2次，5 min/次，二抗(稀釋比1 ∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min，5 min/次。采用ECL試劑發(fā)光后，在凝膠圖像分析儀檢測(cè)目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各濃度丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL丙泊酚處理后的胃癌細(xì)胞吸光度值均低于0 μg/mL丙泊酚處理的胃癌細(xì)胞(均P<0.05)，隨著丙泊酚干預(yù)濃度的升高，胃癌細(xì)胞吸光度值隨之降低(均P<0.05)，見表1。與0 μg/mL丙泊酚組相比，15 μg/mL丙泊酚處理后的胃癌細(xì)胞增殖抑制率約為50%，故選用15 μg/mL的丙泊酚處理胃癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 各濃度丙泊酚干預(yù)后胃癌細(xì)胞吸光度值的比較(x±s)

2.2 各組胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期分布情況和cleaved Caspase-3、cyclin D1蛋白表達(dá)量的比較 與對(duì)照組相比，丙泊酚組胃癌細(xì)胞的吸光度值、S期細(xì)胞比例、G2/M期細(xì)胞比例、cyclin D1蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05)，G0/G1細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量均增加(均P<0.05)；與丙泊酚組相比，干預(yù)組胃癌細(xì)胞的吸光度值、S期細(xì)胞比例、cyclin D1蛋白表達(dá)量均增加(均P<0.05)，G0/G1細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 各組胃癌細(xì)胞凋亡和Western blot條帶圖

表2 各組胃癌細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡情況和cleaved Caspase-3、cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

2.3 各組胃癌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較 與對(duì)照組相比，丙泊酚組細(xì)胞的β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05)；與丙泊酚組相比，干預(yù)組細(xì)胞的β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)量均增加(均P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 Wnt信號(hào)通路Western blot條帶圖

表3 各組胃癌細(xì)胞中β-catenin、C-myc蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

丙泊酚是臨床常用的麻醉藥，除麻醉作用以外，丙泊酚還具有減輕神經(jīng)損傷、提高免疫功能的作用[10]。有研究表明，丙泊酚有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[11]。丙泊酚可在體外抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力及腫瘤細(xì)胞血管生成[3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丙泊酚處理后的肺癌細(xì)胞凋亡水平升高[12]。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示，丙泊酚具有抑制胃癌細(xì)胞移植瘤裸鼠的瘤體生長(zhǎng)和胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的作用[5,13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)丙泊酚處理后胃癌細(xì)胞的增殖能力下降，細(xì)胞凋亡增加，表明丙泊酚具有體外抑制胃癌細(xì)胞惡性表型的作用，這與之前的研究結(jié)果[5,13]相符合，提示丙泊酚可能具有抑制胃癌進(jìn)展的作用。

細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，細(xì)胞周期可以分為分裂期和分裂間期，分裂間期是細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備階段，其有序進(jìn)展與細(xì)胞內(nèi)的多種基因表達(dá)有關(guān)[14]。cyclin D1具有調(diào)控細(xì)胞周期G1期的作用，也是目前為止公認(rèn)的原癌基因，其表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展，從而誘導(dǎo)細(xì)胞惡性生長(zhǎng)[15]。與細(xì)胞周期一樣，細(xì)胞凋亡的發(fā)生也是細(xì)胞內(nèi)多種基因共同調(diào)控的結(jié)果[16]。Caspase蛋白家族含有多個(gè)成員，均具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[17]。研究表明，Caspase蛋白成員在正常情況下以無(wú)活性的酶原形式存在，只有被活化后才可以發(fā)揮促凋亡作用[18]。Caspase-3是位于Caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的促凋亡因子，其被激活后能夠不可逆地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)丙泊酚處理后的胃癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量升高，細(xì)胞中cyclin D1蛋白表達(dá)量下降，說明丙泊酚可以通過阻滯細(xì)胞周期抑制胃癌細(xì)胞增殖，以及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

Wnt信號(hào)通路是一個(gè)在腫瘤組織中過度激活的信號(hào)通路，其激活水平越高，腫瘤惡性程度也就越高，抑制Wnt信號(hào)激活可以體外抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)[20]。研究顯示，丙泊酚可以抑制肝癌、膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[7-8]。β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，C-myc是Wnt信號(hào)通路的下游靶基因，其表達(dá)水平高低與Wnt信號(hào)通路激活水平呈正相關(guān)[21-22]。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚可以抑制胃癌細(xì)胞中β-catenin、C-myc蛋白的表達(dá)，而Wnt信號(hào)通路激活劑可以逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，這證實(shí)丙泊酚調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制可能與抑制Wnt信號(hào)通路激活有關(guān)。

綜上所述，丙泊酚具有體外抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與抑制Wnt信號(hào)通路激活有關(guān)。這或許可為研究丙泊酚抗胃癌的作用機(jī)制提供了參考，今后將會(huì)在多株胃癌細(xì)胞和體內(nèi)試驗(yàn)中驗(yàn)證相關(guān)結(jié)果。